妊娠期小鼠血浆促肾上腺皮质激素释放激素水平变化研究

张 曼,彭丽娜,王朝霞

(上海交通大学实验动物中心,上海 200240)

分娩是一个复杂的生理过程,需要母体的准备和胎儿的成熟。分娩的发动是多种激素共同参与的过程,如雌激素(oestrogen)、催产素(oxytocin)、糖皮质激素(glucocorticoid)和促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)等[1]。有研究表明,人类孕期胎盘分泌的CRH进入母体外周血中,随着妊娠周龄的增加,胎盘产生的CRH量逐渐增多,引起母体外周血中CRH升高,在妊娠晚期血浆CRH含量呈直线增加,分娩时达到峰值[2-3],分娩后急剧下降,24 h内血浆CRH浓度基本恢复至正常水平。随着胎盘促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)在妊娠分娩发动中的作用引起越来越多临床和基础研究工作者的兴趣,有人认为存在一个“CRH胎盘时钟”,它决定了妊娠期的长短以及分娩和分娩的时间。CRH拮抗剂的潜在用途目前正在深入研究中。CRH-r1拮抗剂已被用于动物研究,以阐明CRH在囊胚着床和侵袭、早期胎儿免疫耐受和早产中的作用[4-5]。

母体血浆中CRH与分娩发动的关系在非人灵长类动物实验中也得到证实,黑猩猩胎盘和母体血液中CRH水平在整个妊娠期间的变化和人类相似[6],而狒狒胎盘中CRH在妊娠12周就达到高峰[7]。唐美仪等研究发现雌性大鼠动情期下丘脑CRH水平显著升高达(362.08±29.26)pg/mL,间情期为(176.99±17.19)pg/mL[8]。还有研究证实山羊在分娩前后数天母体血浆CRH显著升高,在分娩前的72 h由约4 μg/L上升到分娩时最高达24 μg/L[9]。

随着生命医药学科及实验动物科学的发展,实验小鼠作为生物医学研究中用量最大的哺乳类实验动物之一,其质量优劣直接影响试验结果的准确性和可重复性。如何提高实验动物的微生物等级,是许多研究者探索的课题。目前,通过生物净化提高被病原微生物污染的实验小鼠的微生物级别越来越受到人们的关注。剖宫产净化是利用胎盘能够阻断病原微生物入侵胎儿的天然屏障作用,通过手术的方法阻断母鼠携带的病原微生物传染给后代,以提高仔鼠的微生物级别[10]。该方法在悉生动物的培育和维持中发挥着重要作用,是基因工程小鼠生物净化维持种群微生物级别最为简单、有效的方法。实验小鼠妊娠期为18.5～20 d,对于需要剖宫产手术的小鼠,其分娩期的判断至关重要。

基于人类与其他动物妊娠期血浆中CRH在分娩中的研究,本试验以C57BL/6小鼠为研究对象,通过对不同孕鼠妊娠期间血浆中CRH的测定,探讨小鼠血浆中CRH水平与分娩时间的关系,利用CRH在妊娠期的变化规律,达到准确预测小鼠分娩时间的目的,为剖宫产手术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 本研究中所用的实验动物均饲养于上海交通大学实验动物中心SPF屏障设施内(温度20～26℃,相对湿度40%～70%,明暗交替12 h/12 h),实验动物使用许可证:SCXK(京)2018-0028。用于合笼的C57BL/6小鼠,雌鼠90只,6～8周龄;雄鼠45只,8～12周龄,SPF级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。本实验已经通过上海交通大学福利伦理审查委员会审查,伦理编号为A2020012。

1.1.2 主要试剂 小鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)试剂盒(ELISA),泉州市睿信生物科技有限公司产品;试剂盒组成及配制HRP-检测抗体:底物A、B;CRH标准品溶液6支:其浓度依次为2.5、5、10、20、40、80 pg/mL;20×洗涤缓冲液,去离子水1∶20稀释备用;试剂盒灵敏度:最低检测值<0.1 pg/mL;重复性:板内变异系数<10%,板件变异系数<15%。

1.1.3 主要仪器 酶标仪(ELX800),美国伯腾仪器有限公司产品;37℃恒温箱(DK-8A),上海精宏实验设备有限公司产品;低温离心机(Centrifuge 5424),德国艾本德股份公司产品;旋涡混合仪(VORTEX2),美国SI仪器公司产品;超低温冰箱(Scientific 51025411),赛默飞世尔科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠合笼及检栓 性成熟的小鼠在第1天PM6:00合笼(1♂∶2♀),第2天AM9:30之前完成检栓。见栓小鼠共有72只,随机分为6组,每组12只见栓小鼠,组别标号为1至6,见栓当天孕期标记为0.5 dpc。

1.2.2 样本采集及处理 自见栓当天起至小鼠分娩后24 h结束,每天上午10点,通过面颊采血的方法对见栓小鼠采集血样。根据试验分组,每天采集1组,每次收集的全血样本放置在室温下静置2 h后,置于低温离心机中,1 000 r/min离心20 min,取上清保存于-80 ℃冰箱备用。

因阴道检栓法存在假阳性现象,在实验样本收集过程中共有16只假阳性小鼠,在数据分析时将其从实验组剔除。至见栓小鼠分娩结束,除16只假阳性小鼠外,正常分娩的小鼠(顺产组)为36只,12只小鼠发生流产或早产(早产组),8只小鼠的妊娠期超过了20 d(难产组)。

1.2.3 绘制CRH标准曲线 CRH标准品购自睿信生物科技有限公司,测定不同浓度的标准品的OD值,并绘制CRH标准曲线。

表1 不同浓度的CRH标准品OD值

1.2.4 血浆CRH的测定 采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。反应体积为100 μL,450 nm波长下测定样品的吸光度(OD值),计算各样本浓度。具体操作如下:从4℃冰箱中将试验所需的板条取出,放置在室温下平衡20 min。在板条上标记好标准品孔和样本孔,根据浓度由低到高,依次加入50 μL标准品至标准品孔中。向样本孔中加入50 μL待测样本。设置空白孔作为阴性对照。除阴性对照外,标准品孔和样本孔中分别加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体,并用封板膜封住反应孔,放置于37℃恒温箱中孵育60 min。孵育结束后弃去液体,用吸水纸吸去剩余的液体,然后每孔加入350 μl洗涤液,静止1 min,弃去洗涤液,并在吸水纸上拍干。重复上述操作5次。每孔加入底物A和底物B各50 μL,放置于37℃恒温箱中避光孵育15 min。每孔中加入50 μL终止液,室温下放置15 min,在450 nm波长处测定各孔的OD值。

2 结果

2.1 CRH标准曲线

CRH标准曲线见图1。

2.2 正常分娩组孕鼠不同妊娠时间血浆中CRH水平含量

正常分娩组孕鼠血浆中的CRH水平在妊娠早期即升高,妊娠13.5 d起血浆CRH水平呈进行性升高,妊娠晚期升高显著,至分娩时达最高水平,分娩后24 h CRH值基本恢复至正常值,结果如图2所示。

图2 不同妊娠期小鼠CRH水平

2.3 早产组和难产组孕鼠不同时期血浆中CRH含量的变化

从13.5 d起,早产组血浆CRH水平即持续高于正常分娩组,两者差异显著(P<0.05),分娩时无明显差异;从13.5 d起,难产组CRH水平低于正常分娩组(P<0.05),分娩时无明显差异,详细结果见表2。

表2 早产组和难产组孕鼠不同时期血浆CRH水平的变化

2.4 妊娠中期(13.5dpc)孕鼠血浆中CRH水平与妊娠持续时间的关系

怀孕13.5 d时小鼠血浆CRH水平与妊娠持续时间呈负性相关,相关系数R2=-0.9119(P<0.001)。怀孕13.5 d的小鼠,血浆中CRH水平异常升高时,则后续妊娠持续时间短;而血清CRH水平偏低时,后续妊娠持续时间长,结果见图3。

图3 孕鼠13.5 d时血浆CRH水平与妊娠时间的关系

3 讨论

促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)是一种参与应激反应的肽类激素,含有41个氨基酸残基,属于促皮质素释放因子家族,最初从绵羊下丘脑分离得到,主要功能是刺激垂体合成ACTH,作为下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的一部分。在猪的黄体中期,CRH降低了孕激素,而不是雌激素或PGF2α[11],在大鼠的雌性生殖组织中发现CRH可能通过受体介导的机制抑制胚胞着床[12],在小鼠中也有类似的发现[13]。在人来和非人灵长类动物的研究中发现,妊娠期胎盘和胎膜产生大量CRH[14],CRH在这些组织中的合成随着妊娠的进展而增加,到足月时,CRH在母体和胎儿的血液以及羊水中以高浓度存在[15]。足月妊娠时,胎盘CRH通过刺激蜕膜和胎膜分泌前列腺素来促进子宫肌层收缩,并增强催产素和前列腺素对子宫肌层的收缩作用[16]。

通过对正常分娩和早产孕妇血浆中CRH的研究发现,早产孕妇CRH血浆水平明显高于足月分娩的孕妇,而足月延后分娩的孕妇CRH血浆水平明显低于足月分娩孕妇[14]。在非灵长类哺乳动物中,妊娠结束与母体孕酮浓度下降有关,这有助于分娩的开始。在人胎盘中,皮质醇能够与黄体酮竞争CRH调节作用[17]。因此,皮质醇对孕酮的阻断可能是分娩启动的一个机制。

在大鼠研究中发现CRH-R1可诱导皮肤肥大细胞发生脱颗粒作用[18],进而引发血管舒张,使血管的通透性增大,而肥大细胞膜稳定剂则可抑制这一作用的发生;采用利多卡因局部浸润麻醉的方法并没有改善CRH-R1增大血管渗透性的作用。而在缺乏肥大细胞的大鼠皮肤中, CRH-R1没有引发血管舒张作用。由此我们推测,胎膜中的CRH-R1与CRH结合后,介导了肥大细胞脱颗粒作用,激活了相关的炎症因子,从而增大血管的通透性,引发胎膜发生一系列的反应,最终发动分娩。

小鼠的妊娠周期相比其他哺乳动物而言较短,一般为19 d±0.5 d。在剖宫产手术净化中,准确判定小鼠的分娩时间至关重要,而阴道栓推断方法需要实验人员每天进出饲养室两次检查阴栓,不仅增加了实验人员的工作量,耗费时间,而且存在漏检和假阳性的现象。触诊法对实验人员要求较高,需具有准确而熟练的触诊技术,否则触诊摸胎将会引发孕鼠应激反应,出现早产或难产。另外,摸胎判断也会因人而异,不能完全准确判断手术时间,进而影响手术的成功率。

本试验以C57BL/6小鼠为研究对象,从见栓当天起对孕鼠血浆中CRH含量进行连续测定,至分娩后24 h结束,分析不同妊娠时间小鼠血浆CRH水平的变化和与血浆CRH与妊娠持续时间的关系。结果显示正常怀孕的小鼠自妊娠13.5 d起血浆中CRH水平呈进行性升高,至分娩时达到最高值,而分娩结束后很快降至正常水平。出现早产的小鼠,在妊娠期CRH水平变化趋势与正常分娩小鼠相似,但在相同妊娠时间的CHR水平高于正常分娩组;超过20 d之后生产的小鼠,虽然分娩时CRH水平与正常分娩组相似,但在相同妊娠时间CHR水平却低于正常分娩组。结果表明血浆中CRH水平是随着妊娠时间的增加而逐渐升高的,当血浆中CRH水平升高达到一定水平时则发动分娩。

综上所述,通过检测孕鼠妊娠期血浆中CRH水平,对比CRH在妊娠期的变化规律,能够准确判断孕鼠的妊娠时间,进而可以知道孕鼠的分娩时间,大大提高剖宫产手术的成功率,为基因工程小鼠的剖宫产生物净化,悉生动物的培养和无菌小鼠的生产奠定了基础。