鸭疫里默氏菌噬菌体宿主谱的拓宽

程龙飞,江南松,刘荣昌,傅秋玲,梁齐章,万春和,黄 瑜,傅光华,陈红梅

(福建省禽病防治重点实验室,福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建省畜禽疫病防控产业技术创新研究院,福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州 350013)

鸭传染性浆膜炎是由革兰氏阴性的鸭疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer)引起的主要侵害雏鸭和雏鹅的一种慢性或急性败血性传染病,导致死亡、耐过鸭生长迟缓和胴体淘汰等,造成重大的经济损失[1]。药物曾经在该病的防治方面发挥了重要作用,但实际生产中盲目用药、不按规定疗程、不按规定剂量用药等不规范用药行为导致鸭疫里默氏菌耐药性增强,越来越多的鸭疫里默氏菌分离株存在多重耐药现象[2-4],使得有效抗菌药物的种类越来越少,给该病的临床预防和治疗带来困难。细菌耐药性问题已成为全球高度关注的重大共性问题。细菌耐药性的迅速发展和新型化学药物研发进度的缓慢,已导致了全球畜牧业的巨大经济损失。在此背景下,噬菌体防治技术重新受到人们的高度重视,成为研究热点。

噬菌体是细菌的病毒,可特异性裂解细菌。早在1919年,科学家就将噬菌体用于禽伤寒的预防和控制,取得了较好的效果[5]。目前,噬菌体疗法在畜禽养殖、水产养殖、人类疾病、食品领域都有成功应用的报道[6-7]。分离的天然噬菌体株多数具有高度特异性,仅针对某一种细菌内的部分菌株[8],并不适合临床应用。为此,将多种或多株同种具有不同裂解谱的噬菌体制成混合制剂即鸡尾酒(phage cocktail)可以保证治疗的有效性[9]。实验室条件下拓宽噬菌体的噬菌谱,建立噬菌谱较宽的噬菌体库,减少噬菌体鸡尾酒制剂中的噬菌体数量,不仅可以降低生产成本,还能简化生产工艺,具有广阔的应用前景。本研究将鸭疫里默氏菌噬菌体混合,与宿主菌、多重耐药鸭疫里默氏菌分别培养,收获的噬菌体再次混合,同样的方法传代,结果显示,30代噬菌体混合液及从中分离出的单一噬菌体,能裂解的菌株数量增加了,即噬菌谱拓宽了,试验证明建立的方法可以拓宽噬菌体的噬菌谱。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和毒株 6株鸭疫里默氏菌噬菌体,vB_RanS_202(宿主菌为RAf488)、vB_RanS_205(宿主菌为RAf32)、vB_RanS_1016(宿主菌为RAf63)、vB_RanS_082(宿主菌为RAf40)、vB_RanS_1018(宿主菌为RAf71)和vB_RanS_092(宿主菌为RAf19)。RAf11等18株对常用药物耐受10种及以上的鸭疫里默氏菌,详见表1。均保存于福建省农业科学院畜牧兽医研究所。

表1 实验用噬菌体和鸭疫里默氏菌一览表

1.1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptic Soy Agar,TSA),胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth,TSB),Luria-Bertani琼脂(LB琼脂),广东环凯微生物科技有限公司产品;上层琼脂,按LB琼脂配方将干粉减半。96孔细胞培养板,220 nm针头式滤器,氯化钠(NaCl),硫酸镁(MgSO4),甘油,1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)等,生工生物工程(上海)股份有限公司产品。SM缓冲液(100 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgSO4·7H2O、50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5),SMG缓冲液(含20%甘油的SM缓冲液)本实验室配制,高压灭菌后室温保存。

1.1.3 主要仪器 生物洁净工作台(BCM-1000A),苏州安泰空气技术有限公司产品;恒温培养箱(GNP-9080),上海精宏实验设备有限公司产品;离心机(Sorvall biofuge stratos),德国Thermo Electron LED GmbH公司产品;数显恒温水浴锅(HH-4),青岛聚创环保集团有限公司产品;高压灭菌器(MLS-3750),日本SANYO公司产品;酶标仪(ELX800),美国Bio-Tek公司产品;二氧化碳(CO2)培养箱(WCI-180),德国WIGGENS公司产品。

1.2 方法

1.2.1 鸭疫里默氏菌的培养 取鸭疫里默氏菌冻干粉,划线培养于TSA平板,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养16～20 h,挑3～6个菌落接种于20 mL TSB,37℃振荡培养10～16 h,当OD525值为1.0～1.5时置2～8 ℃保存,3 d内使用。

1.2.2 噬菌体的培养 将适当浓度的噬菌体和相应的宿主菌混合,加入50 ℃水浴的上层琼脂,铺于TSA平板上,自然冷却凝固后置37 ℃培养16～20 h,挑取平板上层琼脂中的成片或单个噬斑,浸泡于1 mL SM缓冲液中数小时,吸上清经220 nm针头式滤器过滤即为噬菌体液。

1.2.3 噬菌体效价的测定 按文献[10]的方法,将噬菌体液以SM缓冲液进行连续10倍稀释,取适当稀释度的噬菌体液100 μL,与新鲜培养的宿主菌100 μL混匀,37℃水浴15 min,加入50 ℃水浴的上层琼脂,混匀后立即倒入TSA上制成双层平板,待琼脂凝固后将平板置37 ℃、5% CO2培养箱中培养16～20 h后统计噬菌斑,并推算原噬菌体的浓度,以空斑形成单位(plaque forming unit,PFU)/mL表示,为保证结果的可靠性,每个稀释度做2个重复,取平均值。

1.2.4 噬菌谱的测定 采用噬斑分析法,以SM缓冲液将待测噬菌体液作10倍连续稀释至10-5。鸭疫里默氏菌菌液,与50 ℃水浴的TSA混合,铺于平板上,室温放置60 min。将平板分区,每区滴加5 μL各稀释度噬菌体,待液体吸收后转至37 ℃、5%CO2培养箱中培养16～20 h,观察平板上各区的噬斑。当高浓度噬菌体液形成大噬斑,随着浓度的降低,可以见到数量不等的小噬斑时,提示该噬菌体可以裂解相应的菌株。

1.2.5 噬菌谱拓宽试验方法 将效价为1×109PFU/mL的6株噬菌体等量混合,标记为HRE-0。取96孔细胞培养板,旋转90度,每板12行8列。每列重复,第1列每孔加入180 μL HRE-0,其余所有孔,每孔加入180 μL TSB。吸20 μL HRE-0加入第2列的孔中,混匀,吸出20 μL加入第3列中,依次稀释至第7列,吸出20 μL弃去。第8列作为对照。取24株鸭疫里默氏菌培养液,每行加入1株,每孔20 μL。置37 ℃、5% CO2培养箱中培养16～20 h。以酶标仪测定各孔的OD490值,将同一行的数值进行比较。将低于对照孔OD490值60%的实验孔及前1孔的培养液吸出,如果所有实验孔的OD490值都与对照孔的接近,则将第1、2列孔中的培养液吸出,所有吸出的培养液混合,加入100 μL氯仿,轻轻颠倒混匀,10 000 g离心2 min,吸上清用220 nm针头式滤器,滤液标记HRE-1。采用同样的方法继续传代,共进行30次传代。余下的加入终浓度为20%的甘油,保存于-20 ℃。

1.2.6 不同代次噬菌体混合液的噬菌谱测定 取HRE-0、HRE-5、HRE-10、HRE-15、HRE-20、HRE-25、HRE-30的噬菌体混合液,按1.2.4的方法测定各混合液对24株鸭疫里默氏菌的裂解情况。

1.2.7 30代噬菌体混合液中单一噬菌体的分离及噬菌谱测定 将HRE-30的噬菌体混合液适当稀释,分别与6株宿主菌、新增加的能被裂解的13株菌菌液铺双层平板,培养后各挑取6个单噬斑,分别浸泡于1 mL SM缓冲液数小时并不时颠倒混匀,吸取液体经过220 nm针头式滤器,加入终浓度为20%的甘油,保存于-20 ℃。标记为HRE-30/RAf488-1、HRE-30/RAf488-2等,按1.2.4的方法测定各单一噬菌体对这19株鸭疫里默氏菌的裂解情况。

1.2.8 单一噬菌体的稳定性 将1.2.7筛选出的能裂解菌株数量最多的5株噬菌体,以原培养菌为宿主菌,传代10次。按1.2.4的方法测定传代后噬菌体的噬菌谱。

1.2.9 噬菌体鸡尾酒的噬菌谱测定 根据1.2.7筛选出的结果,将具有互补特点的、能裂解菌株数量较多的4株噬菌体等量组合成鸡尾酒CT1、CT2、CT3和CT4,按1.2.4的方法测定对19株菌株的裂解情况。

2 结果

2.1 不同代次噬菌体混合液的噬菌谱

6株噬菌体的混合液与6株宿主菌及18株非宿主多重耐药鸭疫里默氏菌培养后,第5代混合液可裂解的菌株数迅速增加至14株,随着培养代次的增加,能裂解的菌株数缓慢增加,第25代和30代混合液能裂解的菌株数量稳定在19株,仍有5株细菌不能被裂解,详见表1和图1。

图1 不同培养代次噬菌体混合液的裂解特点

2.2 从30代噬菌体混合液分离出的单一噬菌体的裂解特点

HRE-30噬菌体混合液,与能裂解的19株鸭疫里默氏菌分别铺双层平板,共挑出114株单斑噬菌体,这些单一噬菌体对19株菌的裂解特点见表2,其中能裂解细菌菌株数量最少的仅为2株,最多的为9株,多数单一噬菌体(66.7%)能裂解的细菌菌株数为4～6株。裂解9株细菌的单一噬菌体有5株,分别是以RAf488、RAf32和RAf71为宿主菌培养获得的。单一噬菌体能裂解的菌株数远低于HRE-30能裂解的菌株数,但多数超过了原始噬菌体株。

表2 HRE-30分离出的单一噬菌体的裂解特点

2.3 单一噬菌体的稳定性

将能裂解9株细菌的5株单一噬菌体HRE-30/RAf488-5、HRE-30/RAf32-3、HRE-30/RAf32-4、HRE-30/RAf488-1、HRE-30/RAf71-1,以原培养菌为宿主菌传代10次,对19株鸭疫里默氏菌的裂解情况没有发生改变。

2.4 噬菌体鸡尾酒的噬菌谱

4个噬菌体鸡尾酒的组成见表3,均能裂解19株鸭疫里默氏菌。

表3 噬菌体鸡尾酒的组成

3 讨论

噬菌体是细菌的病毒,由于细菌基因组的快速进化[11]及固有免疫原性[12]共同导致天然噬菌体株的宿主范围很窄,特定的天然噬菌体株通常只能裂解一个细菌种内的少数菌株,极少覆盖所有临床流行的致病菌株。前期的研究表明,77.14%的鸭疫里默氏菌噬菌体对临床分离株裂解率低于20%,即噬菌谱较窄,这一点限制了天然噬菌体的临床应用[13]。但噬菌体的宿主特异性不是一成不变的,已有的研究表明,噬菌体可以与细菌在生长循环过程中相互作用并共同进化,使得噬菌体能够发生适应性变异[14-15]。本研究针对现有噬菌体不能裂解的多重耐药鸭疫里默氏菌临床分离株,开展已有噬菌体的噬菌谱拓宽试验,结果证实培养后的噬菌体混合液及从混合液中分离出来的单一噬菌体的宿主范围都拓宽了,单一噬菌体能裂解的菌株数量远低于噬菌体混合液,但比初始噬菌体有了一定程度的增加。本研究建立的噬菌谱拓宽方法和分离到的相对宽谱噬菌体,为今后噬菌体鸡尾酒制剂的制备提供了侯选毒株,具有一定的实用性和潜在的应用前景。

常用的拓宽噬菌体噬菌谱的方法有共培养法和基因改造法。周艳等[16]将高效价的产肠毒素大肠埃希氏菌的噬菌体JS09按MOI为100的比例与非宿主的肠出血性大肠埃希氏菌进行多轮共培养,筛选到6株能同时裂解上述两种细菌的噬菌体,拓宽了亲本噬菌体JS09的宿主谱。徐焰等[17]将高浓度噬菌体与6株非宿主菌混合液进行长时间、多周期的混合培养,使大肠埃希氏菌噬菌体XY-1的噬菌谱扩展至非其宿主菌的4株大肠杆菌,且经过30周期的传代培养仍具有多宿主裂菌效应。Mapes A C等[14]将铜绿假单胞菌特异性噬菌体与多株耐药性不同的铜绿假单胞菌经过多轮共培养,不仅拓宽了噬菌体的宿主谱,还能有效抑制铜绿假单胞菌形成生物膜。本研究将6株噬菌体混合液分别与宿主菌和18株多重耐药鸭疫里默氏菌经过多轮共培养,也成功获得噬菌谱拓宽的噬菌体。Yosef I等[18]将T7-like噬菌体的尾部蛋白基因与其他噬菌体的类似基因进行替换,出现了可预测的宿主范围变化。T3噬菌体通过尾丝蛋白上的4个不同区域结合其宿主受体,Yehl K等[19]针对这4个DNA区域设计随机简并引物,整合至尾丝蛋白基因上,建立了一个多样性非常大的突变噬菌体库,进而产生能够感染新宿主的噬菌体。Zhang J等[20]将T5-like沙门氏菌噬菌体的长尾丝蛋白进行编辑,获得宽宿主范围的工程噬菌体。基因改造法可以按预定的目标对噬菌体的噬菌谱进行改造,具有非常重要的应用价值,这也是我们接下来的研究方向。

本研究建立了一种可以拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,既能获得噬菌谱更宽的噬菌体混合液,也能获得稳定的噬菌谱更宽的单一噬菌体。