禾肾丸通过调控ANGPTL3治疗阿霉素肾病大鼠蛋白尿及血脂代谢紊乱的实验研究

何怡然,欧阳林旗,徐文峰,郭宇鸽,肖望重,黎 旭

(湖南中医药大学第一附属医院 1.药学部,2.肾内科,湖南 长沙 410013)

肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)是一组临床征候群,根据不同的发病原因可分为原发性及继发性[1],其中原发性肾病综合征(primary nephrotie syndrome,PNS)病人病情持续性进展,最终可发展成为终末期肾功能衰竭而死亡[2]。目前针对PNS多采用糖皮质激素联合免疫抑制剂方案进行治疗,尽管短时间内可获得较好的疗效,但药物不良反应较多,部分病人无法坚持完成整个疗程[3]。近些年中医药以其疗效显著、安全性高等特点逐渐应用于PNS的治疗中,其中禾肾丸治疗PNS等慢性肾脏疾病均获得良好的治疗效果,尤其在减轻大量蛋白尿和调节血脂代谢紊乱方面具有特殊的功效,但其具体作用机制尚不明确[4-5]。血管生成素样蛋白3(angiopoietin protein like 3,ANGPTL3)是一种糖蛋白,其具有抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)的生理学功能,使得血脂表达水平显著性升高,同时还可通过影响肾小球滤过功能而在蛋白尿发生过程中发挥重要的作用[6]。阿霉素肾病模型为十分经典的慢性肾脏病模型[7],本研究拟构建阿霉素肾病大鼠动物模型,探讨禾肾丸是否通过调控ANGPTL3而治疗PNS蛋白尿及血脂代谢紊乱,从而为禾肾丸临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物

50只SD大鼠均购自湖南中医药大学动物实验中心,均为雄性,置于SPF级环境下由专人进行饲养,3月龄,体质量为(197.2±25.7)g,室内温度为22 ℃,湿度为45%～75%,每日光照12 h,每只大鼠均分笼饲养。本研究均符合动物实验相关条件及动物实验伦理委员会审核监督。

1.2实验药物

阿霉素粉针剂购自广东星昊药业有限公司;强的松购自浙江仙居制药股份有限公司;禾肾丸为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂,药物组成成分为沙苑子100 g,山药100 g,醋炙牡蛎50 g,醋炙龙骨50 g,莲子100 g,芡实50 g,大枣50 g,黄柏20 g,糯米50 g。所有药物成分均符合相关质量要求并经过专业鉴定。上述药物成分粉碎处理成细粉,然后将糯米用水煮开后取汁液,与药物细粉混合均匀后制丸,干燥处理后即制成药丸。

1.3造模方法

SD大鼠经3 d适应性饲养后置于固定器中,充分暴露鼠尾并采用50 ℃温水浸泡处理数分钟,使得尾静脉呈充盈状态,将阿霉素粉针剂溶于注射无菌用水中配制成2 mg/mL浓度的阿霉素溶液,以6 mg/kg的药物剂量注射至大鼠尾静脉,3 d后检测大鼠血白蛋白及血脂水平,如出现低白蛋白、高血脂等情况提示造模成功。

1.4分组研究

50只SD大鼠按数字表法随机分为5组,每组10只,空白组:不作特殊处理,仅予以每日清晨蒸馏水灌胃,剂量为1 mL/kg;模型组:造模成功后每日清晨蒸馏水灌胃,剂量为1 mL/kg;禾肾丸组:将禾肾丸研碎后溶于蒸馏水中,配制成0.133 g/mL的药物溶液,造模成功后每日清晨以1.8 g/kg剂量灌胃;对照组:造模成功后每日清晨以强的松(药物剂量为6 mg/kg)灌胃;联合用药组:造模成功后每日清晨以强的松、禾肾丸灌胃,药物剂量同对照组和禾肾丸组。各组均灌胃8周。

1.5观察指标

1.5.1 行为学改变 密切观察各组大鼠造模及研究期间日常饮食、精神状态、体毛顺滑程度、活动状态、大小便、水肿严重程度等行为学改变。

1.5.2 24 h尿蛋白定量检测 分别采集各组大鼠造模前1 d及造模后第2、4、6、8周末的24 h尿液,采集标本当日禁食不禁水,采用酶标仪定量检测24 h尿蛋白水平。

1.5.3 血清ANGPTL3及血脂相关指标检测 各组大鼠实验第8周末全身麻醉处理后剪开胸腹腔采集5 mL腹主动脉血液,3 000 r/min离心处理10 min后采集上层血清备检,采用全自动生化仪检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等血脂指标(试剂盒购自北京中山生物技术有限公司),采用酶联免疫吸附法检测血清ANGPTL3表达水平(试剂盒购自美国R&D公司)。

1.6统计学方法

采用方差分析、q检验和相关分析。

2 结果

2.1各组大鼠造模前后行为学改变比较

各组大鼠造模前行为学未出现异常,造模后第1周模型组、禾肾丸组、对照组及联合用药组大鼠的活动、反应、饮食、皮毛光亮柔顺等均差于空白组,造模后第8周模型组大鼠出现活动减少、反应减弱、食欲下降、精神倦怠、蜷缩成团、皮毛光亮柔顺度明显降低、脱毛明显增加等行为学改变,而禾肾丸组、对照组及联合用药组上述行为学改变优于模型组。

2.2各组大鼠不同时间点24 h尿蛋白水平比较

各组大鼠造模前1 d 24 h尿蛋白水平比较差异无统计学意义(P>0.05),造模后第2、4周模型组、禾肾丸组、对照组及联合用药组大鼠24 h尿蛋白水平均明显高于空白组(P<0.05),而组间比较差异无统计学意义(P>0.05),造模后第6、8周禾肾丸组、对照组大鼠24 h尿蛋白水平明显高于联合用药组和低于模型组(P<0.05),而禾肾丸组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠不同时间点24 h尿蛋白水平比较

2.3各组大鼠血脂相关指标及血清ANGPTL3表达水平比较

模型组、禾肾丸组、对照组及联合用药组大鼠TC、TG、LDL-C血脂指标及血清ANGPTL3表达水平均明显高于空白组(P<0.05),而HDL-C均明显低于空白组(P<0.05),且禾肾丸组、对照组大鼠TC、TG、LDL-C及ANGPTL3均低于模型组和高于联合用药组(P<0.05),HDL-C均高于模型组和低于联合用药组(P<0.05),而禾肾丸组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠血脂相关指标及血清ANGPTL3表达水平比较

2.4各组大鼠血清ANGPTL3表达水平与24 h尿蛋白及血脂相关指标的相关性分析

各组大鼠血清ANGPTL3表达水平与TC、TG、LDL-C及24 h尿蛋白均呈正相关关系(P<0.05～P<0.01),而与HDL-C呈负相关关系(P<0.05～P<0.01)(见表3)。

表3 各组大鼠血清ANGPTL3表达水平与24 h尿蛋白及血脂相关指标的相关系数(r)

3 讨论

3.1PNS的发病机制

PNS等慢性肾病已成为影响世界各国人民公共健康的重要问题,其中蛋白尿是各种慢性肾病病人病情持续发展的独立危险因素,而足细胞损伤是导致蛋白尿发生的重要原因,也是NS病人肾脏常见的病理改变[8]。足细胞是构建肾小球滤过屏障系统的重要成分,其受到明显损伤后可诱发蛋白尿,进而出现低蛋白血症、水肿等临床症状[9]。高脂血症等血脂代谢紊乱也是NS的主要临床症状,可使得病人血液呈高凝病理状态,严重者甚至出现血管栓塞[10]。故有效减轻足细胞损伤以改善蛋白尿、纠正高脂血症等血脂代谢紊乱对于防治NS具有重要的意义。

3.2禾肾丸治疗阿霉素肾病的作用

本研究构建阿霉素肾病大鼠模型予以进一步研究,观察各组大鼠造模前后行为学改变发现,禾肾丸组、对照组及联合用药组大鼠的各项行为学均优于模型组,提示禾肾丸与泼尼松改善阿霉素肾病大鼠的行为学效果一致。对各组大鼠血脂相关指标及不同时间点24 h尿蛋白水平进行检测则发现,禾肾丸组和对照组大鼠24 h尿蛋白水平和血脂相关指标均优于模型组,但较联合用药组差,而禾肾丸组与对照组比较无明显差异性,提示禾肾丸与泼尼松均可有效改善阿霉素肾病大鼠的血脂代谢紊乱和蛋白尿症状,且两者联合应用效果更佳。分析原因为禾肾丸是根据PNS病人脾肾亏虚、肾失封藏的病理机制,在既往“金锁固精丸”的药方基础上去莲须加莲子,加山药、黄柏、大枣及糯米化裁而成,在减少蛋白尿漏出、减轻高脂血症等方面均有着较好的治疗效果[4-5]。

3.3禾肾丸通过ANGPTL3治疗阿霉素肾病的机制ANGPTL3是一种具有独特信号肽分子结构的序列,较多研究证实其主要表达在肝细胞,可明显抑制LPL的活性功能,显著性增加血清极低密度脂蛋白的表达水平,最终导致TG、TC的分解明显减少,血脂水平明显升高,已被研究人员认为是调控机体内血脂生理代谢过程中的关键因子[11-13]。此外研究还发现肾小球足细胞也能合成和释放ANGPTL3,后者表达水平与蛋白尿、足细胞足突融合程度之间呈正相关关系[14],足细胞合成和释放较多ANGPTL3后,后者可激活活化整合素αVβ3及其相关信号分子,从而导致足细胞骨架蛋白重排、活动功能显著性升高,最终在足细胞足突融合及蛋白尿形成过程中发挥重要的作用[15]。上述研究均证实,ANGPTL3在PNS发病过程中同时参与血脂代谢紊乱、蛋白尿的形成。因此寻找一种能有效抑制ANGPTL3合成和释放的中成药可能起到改善PNS病人蛋白尿及血脂代谢紊乱的治疗目的。相关研究也对禾肾丸的作用机制进行深入研究,但尚未发现其对ANGPTL3的影响[16-17]。本研究检测各组大鼠血清ANGPTL3表达水平发现,其与TC、TG、LDL-C及24 h尿蛋白均呈正相关关系,而与HDL-C呈负相关关系,结果提示ANGPTL3与血脂代谢紊乱及蛋白尿有密切相关性,而禾肾丸可能通过调控ANGPTL3而起到治疗阿霉素肾病大鼠蛋白尿及血脂代谢紊乱的作用。

本研究还存在某些不足之处,如研究时间相对较短,禾肾丸治疗剂量未区分不同剂量组等;此外禾肾丸通过何种信号通路对ANGPTL3进行调控,是否对肾小球足细胞ANGPTL3表达水平产生直接作用等问题仍需以后进一步研究。