HPLC法同时测定健腰密骨片浸膏粉中5种指标成分

商晓慧 赵晓玲 詹常森

摘 要 目的：建立健腰密骨片浸膏粉的多成分定量分析方法，为评价浸膏粉中间体的质量提供依据。方法：采用HPLC法，以乙腈-磷酸鹽缓冲液为流动相，梯度洗脱，测定健腰密骨片浸膏粉中5种成分的含量。结果：木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ5种成分在各自质量浓度范围内呈良好线性关系，r≥0.999 7；5种化合物的平均回收率分别为100.47%、104.37%、95.38%、95.93%、96.66%。该方法的专属性、重复性均良好。结论：该分析方法准确、重复性好，可作为健腰密骨片浸膏粉的质量控制方法。

关键词 健腰密骨片浸膏粉 HPLC 多成分定量分析

中图分类号：O657.72； R286 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2024）03-0071-05

引用本文 商晓慧， 赵晓玲， 詹常森. HPLC法同时测定健腰密骨片浸膏粉中5种指标成分[J]. 上海医药， 2024， 45（3）： 71-75.

基金项目：上海市2021年度“科技创新行动计划”生物医药科技支撑专项项目（21S21903100）

Simultaneous determination of five constituents in Jianyao Migu tablets by HPLC

SHANG Xiaohui， ZHAO Xiaoling， ZHAN Changsen

（Shanghai Hutchison Pharmaceuticals/Shanghai Engineering Research Center for Innovation of Solid Preparation of TCM， Shanghai 201401， China）

ABSTRACT Objective： To establish a multi-component quantitative analysis method for the extract powder of Jianyao Migu tablets and provide a basis for comprehensive evaluation of the quality of extract powder. Methods： The contents of five components in the extract powder of Jianyao Migu tablets were determined by HPLC method with acetonitrile-phosphate buffer as mobile phase and gradient elution. Results： The five components including magnoflorine， salvianolic acid B， epimedin C， icariin and baohuosideⅠshowed a good linear relationship in their respective concentration ranges （r≥0.999 7）. The average recovery rates of 5 compounds were 100.47%， 104.37%， 95.38%， 95.93% and 96.66%， respectively. The specificity and reproducibility of this method were good. Conclusion： The established analytical method is accurate and reproducible， and can be used for the quality control of extract powder in Jianyao Migu tablets.

KEY WORDS extract powder of Jianyao Migu tablets； HPLC； multi-component quantitative analysis

健腰密骨片是上海和黄药业有限公司研发的中药1类新药，于2020年底获得国家药品监督管理局颁发的临床试验许可。处方由黄芪、淫羊藿、墨旱莲、丹参等6味中药经提取、纯化、浓缩、干燥等一系列工艺制备而成。该方为国医大师施杞教授的经验方，具有益气健腰补肾、化痰通络止痛的功效[1]，临床拟用于治疗肾虚血瘀型老年骨质疏松性腰痛。方中黄芪具有补气升阳、固表止汗等功效，含有黄酮、皂苷等活性成分[2]；淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，含有黄酮、木脂素、生物碱等活性成分[3]；墨旱莲具有滋补肝肾、凉血止血等功效，含有黄酮类、三萜类等活性成分[4]；丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦等功效，含有丹酚酸类、丹参酮类等活性成分[5]；青风藤具有祛风湿、通经络、利小便等功效，含有生物碱[6]、挥发油[7]等活性成分；牛膝具有逐瘀通经，补肝肾，强筋骨等功效，含有三萜皂苷、甾酮类等活性成分[8]。

现有的健腰密骨片成品质量标准中规定了黄芪甲苷、淫羊藿苷和丹酚酸B的含量限度，为了更好地控制成品质量，需对浸膏粉中间体进行相关性研究，探索量质传递规律，因此需对中间体指标成分建立含量测定方法。前期参照健腰密骨片黄芪甲苷含量测定方法[9]建立了浸膏粉黄芪甲苷含量测定方法，本研究建立浸膏粉其它主要成分含量的同时测定方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与试药

ACQUITY Arc高效液相色谱仪（沃特斯中国有限公司）；实验室专用超纯水机（重庆利迪现代水技术设备有限公司）；AL204天平、XS205天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SK7210HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

木兰花碱对照品（批号10555，含量≥98.0%计），购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；丹酚酸B对照品（批号111562-201917，供含量测定用，含量以96.6%计）、朝藿定C对照品（批号111780-201905，供含量测定用，含量以94.3%计）、淫羊藿苷对照品（批号110737-202017，供含量测定用，含量以98.1%计）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号111852-202104，供含量测定用，含量以99.2%计）均购自中国食品药品检定研究院；健腰密骨片浸膏粉（批号S190201、211001和S220801）为上海和黄药业有限公司自制商业规模样品；乙腈为色谱纯试剂；水为超纯水；磷酸二氢钾和磷酸为色谱纯试剂；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 溶液制备

1）混合对照品溶液 精密称取对照品木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ适量，加80%甲醇溶解制成每毫升分别含500.03、1 003.0、1 002.0、501.7、202.5 mg的混合溶液。

2）供试品溶液 精密称定健腰密骨片浸膏粉0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液40 mL，称定重量。超声处理（功率350 W，频率53 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇溶液补足减失的量，摇匀，取上清液用有机微孔滤膜（0.22 mm）滤过，取续滤液。

3）阴性样品溶液 根据处方比例和制剂工艺，分别制得缺淫羊藿药材、丹参药材、青风藤药材的单阴性样品和缺淫羊藿和青风藤药材的双阴性样品。按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

1.2.2 色谱条件

Agilent ZORBAX SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；以乙腈（A）-磷酸盐缓冲液（B）（0.02 mol/L的磷酸二氢钾溶液，以磷酸调节pH至2.5）为流动相，按表1的规定进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min；进样量10 mL；紫外检测波长 270 nm（木兰花碱、朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ，保留时间0～80 min），286 nm（丹酚酸B，保留时间30～40 min）。

2 结果

2.1 专属性试验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液、单阴性样品（分别缺淫羊藿、缺丹参、缺青风藤）及双阴性样品（同时缺青风藤和淫羊藿）溶液10 mL进样分析，结果见图1。在木兰花碱对照品出峰位置上缺青风藤、缺淫羊藿的单阴性样品溶液上分别出现干扰峰，而在同时缺青风藤和淫羊藿的双阴性样品溶液上未见干扰峰，说明木兰花碱同时存在于青风藤和淫羊藿药材中，其他药材中各成分对木兰花碱的含量测定无干扰；在丹酚酸B对照品出峰位置上缺丹参阴性样品溶液未见干扰峰，在朝藿定C、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ的3个对照品出峰位置上缺淫羊藿阴性样品溶液未见干扰峰，说明各阴性样品无干扰。

2.2 线性关系、检出限及定量限

精密吸取适量混合对照品溶液，加入适量80%甲醇稀释，使木兰花碱质量浓度分别为12.51、25.02、50.03、100.06、250.15、500.30 mg/mL；丹酚酸B质量浓度为25.08、50.15、100.30、200.60、501.50、1 003.0 mg/mL；朝藿定C质量浓度为25.05、50.10、100.20、200.40、501.0、1 002.0 mg/mL；淫羊藿苷质量浓度为12.54、25.09、50.17、100.34、250.85、501.70 mg/mL；宝藿苷Ⅰ质量浓度为5.06、10.13、20.25、40.50、101.25、202.50 mg/mL。取各个质量浓度的混合对照品溶液进行液相色谱分析。以峰面积为纵坐标（Y），對照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（r）。以信噪比S/N=10时对照品的含量为定量限，以信噪比S/N=3时对照品的含量为检测限，结果显示，各成分在各自的浓度范围内线性关系良好（表2）。

2.3 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液适量，连续进样6次，进行液相色谱分析。结果显示，木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ色谱峰面积相对标准偏差RSD分别为0.40%、0.04%、0.05%、0.15%、0.16%，RSD均小于2.0%，符合2020版中国药典要求[10]，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

平行制备6份样品（批号211001），进行液相色谱检测。结果显示，木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ含量相对标准偏差RSD分别为0.52%、0.69%、0.79%、0.86%、0.78%，RSD均小于3.0%，符合2020版中国药典要求[10]，表明该方法重复性较好。

2.5 加样回收率试验

精密称定9份各成分含量已知的样品（批号211001）0.25 g，分别加入相当于样品中各成分含量的80%、100%、120%的对照品，进行液相色谱测定，计算各成分含量的平均回收率和RSD值。结果显示，木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的平均回收率分别为100.47%、104.37%、95.38%、95.93%、96.66%，相对标准偏差RSD分别为2.88%、1.95%、2.52%、2.87%、4.59%，符合2020版中国药典要求[10]，表明该方法准确度较好。

2.6 稳定性试验

取同一份供试品溶液（批号211001），于室温下放置0、2、4、8、12、18、24、48、72 h时进样分析。结果显示，木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ色谱峰面积在72 h内相对标准偏差RSD分别为0.52%、0.19%、0.20%、0.58%、0.87%，RSD均小于2.0%，表明供试品溶液在室温下放置72 h内稳定。

2.7 耐用性试验

取同一批健腰密骨片浸膏粉（批号211001）制备成供试品溶液，进样测定，考察不同类型/不同批号色谱柱（Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Eclipse Plus-C18）对木兰花碱、丹酚酸B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ含量检测的影响。结果显示不同型号色谱柱检测各指标性成分的分离度均大于1.5，含量RSD均小于5.0%，表明该方法耐用性良好（表3）。

2.8 样品含量测定

取3批健腰密骨片浸膏粉制备成供试品溶液，每批各进样测定2次，计算含量（表4）。结果显示该方法下测定各批次样品含量相对偏差均小于5.0%，表明该方法检测样品含量数据稳定可靠。

3 讨论

研究[11-12]发现木兰花碱同时存在于淫羊藿和青风藤药材中，故本研究同时制备缺淫羊藿、缺青风藤的单阴性样品溶液及缺上述两味药材的双阴性样品溶液，经证实在木兰花碱色谱峰出峰位置上分别缺两味药材的单阴性样品溶液（图1 C和E）均出现干扰峰，在同时缺两味药材的双阴性样品溶液（图1F）未出现干扰峰。

本研究对浸膏粉质量浓度（0.01、0.012 5、0.016 7、0.025、0.05 g/mL）、提取溶剂甲醇浓度（20%、40%、60%、80%）和乙醇浓度（60%）、超声时间（20、30、40、50、60 min）分别进行考察，综合考虑色谱峰数量、峰面积等因素，最终选择0.025 g/mL样品80%甲醇超声提取30 min作为提取条件。

本研究还分别考察了流动相酸盐种类和浓度（水、0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.1%乙酸、乙二胺、0.01 mol/L磷酸二氢钾、0.02 mol/L磷酸二氢钾）对液相色谱分析的影响，发现不同种类酸盐对木兰花碱和丹酚酸B的2个色谱峰峰形和出峰时间影响较大，经过对比研究后选择0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液，再以磷酸调节pH至2.5作为流动相。

综上，本研究建立的健腰密骨片浸膏粉多成分定量分析方法可同时对处方中木兰花碱、丹酚酸B、朝藿苷C、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ共5种成分进行定量分析，体现方中青风藤、丹参、淫羊藿3味药材，可作为健腰密骨片中间体多味药指标成分的检测方法。后期将进行中间体及成品指纹图谱研究，以期对其化学成分进行更全面的表征和控制。

参考文献

[1] 赵晓玲， 商晓慧， 詹常森. 健腰密骨片中丹酚酸B的质量控制方法建立[J]. 上海医药， 2021， 42（13）： 73-76.

[2] 史婉璐， 王红秋. 黄芪化学成分及药理作用综述[J]. 黑龙江科技信息， 2012（15）： 52； 56.

[3] 王焕珍， 柴艺汇， 陈云志， 等. 淫羊藿化学成分与药理作用研究进展[J]. 亚太传统医药， 2016， 12（7）： 63-65.

[4] 席庆菊. 墨旱莲的化学成分、药理作用、加工炮制及临床应用研究进展[J]. 中国处方药， 2018， 16（8）： 15-17.

[5] 王梦梦， 吉兰芳， 崔树娜. 丹参功效的物质基础研究进展[J]. 中医学报， 2019， 34（5）： 944-949.

[6] 宋少辉， 张援虎， 黄筑艳. 青风藤中生物碱的研究[J]. 时珍国医国药， 2011， 22（2）： 327-328.

[7] 陈俊， 周瑾， 何赟鑫， 等. 青风藤中挥发油成分的分析[J].药学实践杂志， 2012， 30（2）： 115-117.

[8] 刘斌， 王彦志， 張萌， 等. 牛膝的化学成分及质量标准研究进展[J]. 河南中医， 2014， 34（11）： 2266-2268.

[9] 许雯雯， 李筱婧， 詹常森. ELSD-HPLC法测定健腰密骨片中黄芪甲苷的含量[J]. 海峡药学， 2022， 34（9）： 35-37.

[10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2020年版四部[M].北京： 中国医药科技出版社， 2020： 63-483.

[11] 张龙， 李珊珊， 白雪， 等. 基于一测多评法的淫羊藿质量评价方法研究及验证[J]. 中国中药杂志， 2021， 46（11）： 2843-2851.

[12] 杨林， 殷永红. LC-MS/MS法测定野生青风藤中木兰花碱和青藤碱含量[J]. 陕西农业科学， 2021， 67（5）： 57-60.