胞葬作用缺陷在动脉粥样硬化发病机制中的研究进展

程陈 张静 黄萃园 何向宇 杨简

动脉粥样硬化易损性斑块的破裂是急性心肌梗死、缺血性脑卒中等不良心血管事件的主要病理机制[1-3]。研究表明，晚期动脉粥样硬化病变中胞葬作用受损可能是不稳定性斑块形成的关键因素。在晚期动脉粥样硬化斑块内，胞葬作用水平仅为正常生理水平的1/20，斑块内有大量凋亡及坏死细胞，死亡细胞崩解释放的产物进一步促使炎症发展和继发性细胞坏死，导致动脉粥样硬化斑块扩大、坏死核心形成和斑块破裂[4]。因此，增强胞葬作用有望成为防治动脉粥样硬化的新靶点。

1 胞葬作用

胞葬作用是吞噬细胞对凋亡细胞的清除过程。人体内每天有约数亿个细胞发生凋亡，因此完整有效的胞葬作用对于机体维持稳态及正常功能至关重要[5]。胞葬作用是一个多步骤、复杂且受精确调控的过程，这一过程由专职的吞噬细胞（包括巨噬细胞和树突状细胞等）以及非专职的吞噬细胞（如上皮细胞、平滑肌细胞等）介导，并受“找我”信号、“吃我”信号、“不吃我”信号和桥接分子等多种信号分子协同调控（表1）。此外，吞噬细胞与凋亡细胞的比例、吞噬细胞的功能状态和凋亡细胞所处的凋亡阶段均是影响胞葬过程的重要因素[6-7]。胞葬过程包括“找我”阶段、“吃我”阶段、吞噬阶段、吞噬后阶段。

表1 胞葬作用相关信号分子

1.1 “找我”阶段

“找我”阶段是胞葬过程中的首要步骤，其作用是向吞噬细胞提供准确的信号，帮助它们快速感知到凋亡细胞并启动胞葬过程。在此阶段中，凋亡细胞释放出一系列“找我”信号，例如趋化因子CX3C配体1（CX3CL1）、鞘氨醇-1-磷酸、溶血磷脂酰胆碱、三磷酸腺苷（ATP）和三磷酸尿苷（UTP）、嘌呤能受体P2Y2 等，这些信号分别与吞噬细胞表面的受体趋化因子CX3C 受体1、鞘氨醇-1-磷酸受体、G 蛋白偶联受体 G2A 家族、G 蛋白偶联受体 P2Y 家族特异性结合后，引导吞噬细胞向凋亡细胞迁移和聚集，从而启动后续的凋亡细胞清除过程[8]。

1.2 “吃我”阶段

“吃我”阶段是指吞噬细胞识别凋亡细胞的过程。细胞程序性凋亡后，凋亡细胞表面暴露出“吃我”信号，“吃我”信号可与吞噬细胞表面的受体以“配体-受体”的形式直接结合，也可通过桥接分子与吞噬细胞表面的受体以“配体-桥接分子-受体”的形式间接偶联，进而激活胞葬级联反应。目前研究较多的“吃我”信号主要为磷脂酰丝氨酸（PtdSer）、钙网蛋白[9-10]。其中，PtdSer 是最关键的“吃我”信号，生理条件下PtdSer 位于质膜内表面，细胞程序性凋亡后，凋亡细胞中的PtdSer 在磷脂转移酶的作用下翻转并暴露于质膜的外表面，PtdSer 可直接与吞噬细胞表面的吞噬受体脑特异性新生血管抑制因子-1、稳定素、CD300、清道夫受体BI 等结合激活胞葬；另外，PtdSer 也可通过结合桥接分子乳脂球样表皮生长因子8 被吞噬细胞上的Mer 酪氨酸蛋白激酶受体（MerTK）识别进而激活胞葬[11]。

1.3 吞噬阶段

“吃我”信号与吞噬细胞表面的受体结合后，继而激活小三磷酸鸟苷（GTP）酶Rho 家族中的Rac1，促使巨噬细胞的细胞骨架发生重组，驱动肌动蛋白在凋亡细胞周围形成“吞噬杯”结构，这种结构有利于巨噬细胞包裹并吞噬凋亡细胞，从而实现对凋亡细胞的吞噬[12]。另外，健康的活细胞通过释放“别吃我” 信号防止自身被胞葬细胞吞噬。目前研究较多的非食我信号分子有CD47、CD31、CD24、CD300 等。其中，CD47 是重要的“别吃我”信号分子之一，广泛表达于几乎所有正常细胞的表面[13]。健康活细胞表面的CD47 分子与巨噬细胞表面的受体信号调节蛋白α（SIRPα）结合，促进含SH2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1/2 磷酸化，抑制肌球蛋白在巨噬细胞突触膜装配位点的积聚，阻碍巨噬细胞细胞骨架在吞噬体周围重排，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用，防止健康活细胞被吞噬[14]。

1.4 吞噬后阶段

吞噬细胞清除凋亡细胞后，细胞内凋亡细胞来源物质（脂质、蛋白质/肽或核酸等）急剧增加。为了应对这种“营养超负荷”，吞噬细胞自身进行代谢重编程，激活多条代谢信号通路，吞噬细胞代谢水平急剧增加，加速对这些代谢产物的消化降解。此时，吞噬细胞通过糖酵解生成大量ATP，促进肌动蛋白聚合和“吞噬杯”形成，以利于后续胞葬作用的连续进行[15]。同时巨噬细胞利用从凋亡细胞中摄取的精氨酸和鸟氨酸代谢生成腐胺，腐胺能够提高Dbl基因（编码鸟嘌呤核苷酸交换因子）mRNA 的稳定性，后者进一步活化Rac1 以驱动肌动蛋白细胞骨架重排，促进之后几轮的连续凋亡细胞摄取[16]。此外，凋亡细胞表面的“吃我”信号与受体结合后能激活或上调肝X 受体和ATP 结合盒转运子A1，促进吞噬细胞胆固醇的代谢与排出[17]。此外，有研究报道，在吞噬后阶段，吞噬细胞还能分泌多种抗炎细胞因子抑制局部免疫反应。如凋亡细胞被吞噬清除后生成的甲硫氨酸可进一步转化为S-腺苷甲硫氨酸，抑制Dusp4基因转录，从而导致前列腺素E2、转化生长因子β 表达水平升高，增强胞葬作用并促进炎症消退[18]。

2 动脉粥样硬化过程中胞葬作用缺陷的分子机制

完整有效的胞葬作用可清除斑块内大量凋亡细胞，防止炎症发展和继发性细胞坏死，提高斑块稳定性，从而减缓动脉粥样硬化的进展。目前的研究发现，动脉粥样硬化斑块中胞葬作用缺陷的分子机制主要与吞噬细胞的吞噬效率降低、凋亡细胞不易识别有关，其中涉及吞噬细胞的绝对数量、吞噬能力下降、胞葬相关信号分子的紊乱、炎症激活、遗传因素等多个环节。

2.1 吞噬细胞的工作效率下降

动脉粥样硬化过程中胞葬作用缺陷可能与多种吞噬细胞的工作效率下降密切相关。巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块高度促炎与毒性环境中自身易发生凋亡或坏死，导致吞噬细胞绝对数量的减少[19]。此外，动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞的极化更倾向于促炎的M1 表型，而具有高吞噬活性的M2 表型比例降低，导致吞噬细胞的吞噬能力相对降低[20]。多项体外实验亦表明，动脉粥样硬化病变进展过程中树突状细胞和平滑肌细胞的吞噬能力也降低[21-22]。

2.2 胞葬相关信号分子紊乱

现已发现多种胞葬作用相关信号分子与动脉粥样硬化病变进展过程中胞葬作用缺陷有关。研究表明，在动脉粥样硬化病变进展过程中，巨噬细胞表面的吞噬相关受体[如MerTK、低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）、清道夫受体-BI（SR-BI）等]表达缺陷与胞葬作用缺陷密切相关[23]。Garbin等[24]发现，颈动脉斑块坏死核心周围的巨噬细胞中MerTK 蛋白表达显著下降。Thorp 等[25]的研究发现，MerTK 受体敲除小鼠的动脉粥样硬化病变坏死核心扩大，斑块内凋亡细胞数量增加。该团队进一步研究发现，晚期动脉粥样硬化斑块中解聚素金属蛋白酶17（ADAM17）的表达增加，ADAM17 使MerTK受体剪切失活，导致巨噬细胞上Mertk 表达降低。此外，剪切后的MerTK 受体胞外段——可溶性 Mer蛋白能够与MerTK 竞争结合桥接分子Gas6 或TAM激酶配体蛋白S（ProS1），进一步加剧胞葬作用功能缺陷[26]。巨噬细胞通过鸟氨酸脱羧酶（ODC）的作用将从凋亡细胞中摄取的精氨酸代谢生成腐胺，Yurdagul 等[27]的研究表明ODC 依赖性腐胺合成可影响MerTK 表达的基础水平。骨髓特异性敲除ODC通过阻碍腐胺合成降低H3K9me2/3 水平，抑制凋亡细胞受体MerTK 的基础表达，进而损害胞葬作用，导致动脉粥样硬化坏死核心增大、纤维帽变薄。此外，在动脉粥样硬化病变进展过程中，ADAM17 使巨噬细胞表面的吞噬受体LRP1 切割脱落[28]，后者具有强烈的促炎作用，其上调多种促炎细胞因子[如肿瘤坏死因子（TNF）-α、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、基质金属蛋白酶（MMP）-9]的分泌，促进并维持血管炎症，抑制胞葬作用[29]。有研究显示，在动脉粥样硬化斑块中，凋亡细胞表面“别吃我”分子CD47 表达异常上调，从而躲避吞噬细胞的胞葬作用[13]。另外，在心肌缺血再灌注损伤期间，凋亡细胞同样表现出CD47 异常高表达，而应用抗CD47 抗体治疗可显著减轻局部的炎症反应、减少心肌梗死面积、改善心脏功能[30]。此外，Mueller 等[31]发现接受抗CD47 抗体治疗的ApoE/LRP1双基因敲除小鼠与对照组小鼠相比在动脉粥样硬化病变大小、坏死核心面积方面没有差异。这提示抗CD47抗体对于胞葬作用的改善作用依赖于LRP1 的存在。事实上，胞葬作用是涉及多种信号分子协同调控的吞噬过程，在动脉粥样硬化病理过程中，致病因素通过损害多个胞葬作用相关信号分子，协同导致巨噬细胞胞葬作用功能缺陷。Zou 等[32]以体外培养的巨噬细胞为研究对象，发现氧化型低密度脂蛋白通过mRNA 和微小RNA（miR）调控，下调胞葬受体（过氧化物酶体增殖物激活受体/ 肝X 受体α/ MerTK）、内化分子[溶质载体（SLC）29a1 ]，上调胞葬作用竞争性受体CD300a，抑制胞葬受体-配体结合过程，加速动脉粥样硬化病变的发生、发展。Jin 等[33]报道，TNF-α 诱导蛋白2 敲低能够通过上调“吃我”受体CD36、清道夫受体-A（SR-A）、SR-B1 表达和下调"别吃我"信号CD47 表达，改善胞葬作用，减轻动脉粥样硬化病变。Yin 等[34]通过体外实验发现，GATA2基因过表达导致多个胞葬阶段的功能缺陷，包括凋亡细胞摄取、吞噬体成熟和吞噬体-溶酶体功能障碍等。

2.3 炎症激活

炎症激活是导致动脉粥样硬化过程中胞葬作用缺陷的重要环节。在动脉粥样硬化进展期，胞葬作用缺陷导致凋亡细胞无法被及时清除，斑块内大量凋亡及坏死细胞累积，死亡细胞崩解释放的产物促使炎症发展和继发性细胞坏死，而炎症激活反过来破坏胞葬信号途径，进一步抑制胞葬作用，以此在动脉粥样硬化持续进展与胞葬作用缺陷之间形成恶性循环。研究表明，动脉粥样硬化斑块中促炎分子TNF-α水平的增加，其可上调凋亡细胞表面的“别吃我”信号分子CD47 的表达，阻止凋亡细胞的清除[13]。此外，晚期动脉粥样硬化斑块中的M1 型巨噬细胞可分泌大量促炎细胞因子[如白细胞介素（IL）-6、IL-β 和TNF-α 等]，导致局部炎症反应加剧，进一步抑制胞葬作用[35]。炎症信号分子高迁移率族蛋白B1 可通过与整合素β3（αvβ3）结合，抑制MFG-E8 与αvβ3 之间的相互作用，此外，炎症信号分子高迁移率族蛋白B1 还可抑制ERK 磷酸化和Rac1 激活[36]。另外，动脉粥样硬化斑块中Toll 样受体4 的表达和活化可抑制桥接分子MFG-E8 的合成，同时抑制“吃我”信号配体MerTK、LRP1 活性，进而降低胞葬作用[37]。特异性促炎症消退介质（SPM）是一类由必需脂肪酸衍生而来的脂质介质。Fredman 等[38]发现，与稳定性斑块相比，易损斑块中SPM 家族中解析素D1的水平显著降低，并伴有白三烯B4的增加。而补充解析素D1 可降低小鼠动脉粥样硬化病变中的活性氧水平，同时诱导胞葬作用激活，从而延缓动脉粥样硬化的发展。最近的研究发现，动脉粥样硬化过程中补体系统激活，尤其增加C3 水平也可以导致胞葬作用受损。Wang 等[39]的研究表明，血清补体C3 水平在心血管疾病的患者中表达水平升高，此外，C3 的表达定位在人类动脉粥样硬化斑块的坏死核心边缘区域。机制研究表明，在动脉粥样硬化发展过程中，C3 由克隆性扩增的血管平滑肌细胞产生，其一方面可通过旁分泌加剧巨噬细胞炎症反应，另一方面可通过自分泌方式触发平滑肌细胞增殖，从而导致动脉粥样硬化斑块的进展。Buono 等[40]发现，与低密度脂蛋白受体（LDLR）敲除小鼠相比，LDLR/C3双敲除小鼠的动脉粥样硬化病变坏死核心扩大，斑块内凋亡细胞数量增加。提示C3 可能通过调理吞噬凋亡细胞影响动脉粥样硬化病变发展。Martin 等[41]的研究发现，因子H 可以抑制C3b 下游补体系统的激活。这使得C3b 的功能被限制在吞噬凋亡细胞时，不会引发过度的免疫反应。此外，因子H 还可以被内化入胞裂解C3 产生C3b 并转移至细胞表面，进一步加速凋亡细胞的清除。Kiss 等[42]的研究亦表明，补体因子H 通过负性调控C3 的消耗，从而限制补体活化，增强胞葬作用，延缓动脉粥样硬化发生。

2.4 遗传因素

近年来遗传因素与胞葬缺陷之间的联系尤其受到学者们的关注。现已证实，携带9p21.3风险等位基因的人群动脉粥样硬化斑块内“吃我”信号Calr 的表达降低，导致胞葬作用缺陷[43]。缺乏细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B基因也被证实与胞葬作用缺陷、动脉粥样硬化斑块不稳定有关[44]。最近的一项研究发现，缺乏乙醛脱氢酶2 促进Rac2 的泛素化降解，阻碍胞葬并促进动脉粥样硬化病变的进展[45]。此外，有学者报道rs9349379-G风险等位基因突变导致肌动蛋白结合蛋白磷酸酶和肌动蛋白调节因子1 表达水平降低，抑制肌动蛋白细胞骨架重组，降低了胞葬作用效率[46]。此外，miR、长链非编码RNA（lncRNA）均被证实与胞葬缺陷有关。在动脉粥样硬化晚期阶段，miR-155 通过靶向抑制B 细胞白血病/淋巴瘤6 的表达，降低RhoA 活性，阻碍巨噬细胞的细胞骨架重组和“吞噬杯”形成，进而损害胞葬作用[47-48]。心肌梗死相关转录本（MIAT）通过靶向miR-149-5p 上调CD47，削弱胞葬能力，导致动脉粥样硬化病变中凋亡细胞积累和斑块不稳定，促进动脉粥样硬化进展[49]。此外，有研究显示，敲除巨噬细胞相关动脉粥样硬化lncRNA 序列（lncRNA MAARS）可通过上调MerTK 受体表达来促进胞葬作用，显著减少动脉粥样硬化斑块面积[50]。

3 针对胞葬作用的干预及治疗研究

大量研究证实胞葬作用受损在动脉粥样硬化斑块进展中起关键作用，因此，靶向增强胞葬作用被视为极具潜力的动脉粥样硬化治疗靶点，具有巨大的应用前景。目前已有多项增强胞葬作用的动脉粥样硬化干预研究在体外实验与小鼠模型上显示了初步成效。

3.1 他汀类药物

研究表明，他汀类药物可通过多种途径调节胞葬作用。他汀类药物可以通过抑制负调节因子RhoA的异丙基化来增强胞葬[51]。此外，他汀类药物增加过氧化物酶体增殖物激活受体和CD36 水平，促进凋亡细胞的识别，进而增强胞葬作用[52]。Jarr 等[53]在小鼠模型及体外细胞实验中均证实，他汀类药物通过抑制“不要吃我”分子CD47 的表达，从而阻断CD47-SIRPα 轴，增强吞噬细胞的胞葬作用，此外他汀类药物还可通过抑制NFκB1 p50 的核易位，减轻炎症反应，发挥抗动脉粥样硬化病变的作用。Cimato等[54]的研究发现，他汀类药物可以抑制CX3CL1 的表达，减少白细胞的黏附和迁移，从而对炎症反应具有抑制作用，发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

3.2 纳米药物载体

随着纳米医学技术的快速发展，基于纳米载体的给药系统备受关注。Chen 等[55]将血小板膜作为包膜材料，开发了纳米粒子药物输送系统，其能够将抗CD47 抗体有效地输送到动脉粥样硬化斑块中，显著减小动脉粥样硬化斑块面积并降低斑块破裂和晚期血栓形成风险。Sha 等[56]设计了一种基于巨噬细胞膜的仿生纳米粒子，其将SIRPα 下游效应分子酪氨酸磷酸酶SHP-1 的小分子抑制剂荷载到纳米粒子中，增强巨噬细胞的胞葬作用，抑制动脉粥样硬化进展。Wang 等[57]构建了一种序贯靶向纳米平台，其能够上调ABC 转运蛋白和MerTK 表达，进而促进胆固醇流出、增强胞葬作用，稳定动脉粥样硬化斑块。Huang 等[58]合成了一种小干扰RNA 纳米颗粒，其能够选择性地沉默巨噬细胞中的CaMK Ⅱγ，上调斑块中MerTK 的表达，提高动脉粥样硬化斑块稳定性。

3.3 中医中药

石榴果实和皮中含有多种活性成分，如多酚类化合物、花青素等，具有抗氧化、抗炎、降血压、降血脂、抗癌等多种功效，其已被证明抗动脉粥样硬化的效果良好。Manickam 等[59]研究发现，石榴皮提取物可阻止MerTK 脱落，增强巨噬细胞胞葬作用，促使动脉粥样硬化斑块坏死面积减少和病变处胶原含量增加，提高斑块稳定性。此外，Zhang 等[60]以LDLR 受体敲除小鼠为研究对象，发现给予冠心康（以瓜蒌薤白半夏汤为基础的一种治疗冠心病的经典中药方剂）干预12 周后，小鼠动脉粥样硬化病变面积明显缩小，其机制可能与冠心康上调Axl、MerTK 和Tyro3 的蛋白表达水平，进而促进细胞吞噬凋亡细胞的能力，增强胞葬作用有关。

3.4 其他

Zou 等[61]的研究发现，间充质干细胞来源的外泌体能够通过上调胞葬受体（SLC2a1、信号转导及转录激活因子3/Rac1）和下调胞葬作用竞争性受体CD300a 来增强调节胞葬作用。该研究团队据此开发了一种新型血管支架，与裸金属支架相比，外泌体支架能够显著增强胞葬作用，延迟了支架内再狭窄的发生。Cao 等[62]发现紫卟啉钠介导的声动力疗法可通过激活半胱氨酸天冬氨酸酶-3，减少泡沫细胞中CD47 的表达，促进兔动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞胞葬作用，并减轻局部炎症。Jin 等[63]发现半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 抑制剂VX765 能够促进巨噬细胞线粒体自噬、增强胞葬作用和M2 型极化，并抑制泡沫细胞形成，从而改善核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3 炎症小体引起的线粒体损伤、动脉粥样硬化和血管炎症反应。此外，Viola 等[64]发现，应用SPM 家族中的Maresin 1 和Resolvin D2 治疗可以促进巨噬细胞的胞葬作用，减少动脉粥样硬化斑块中坏死核心含量。

4 结语

胞葬作用是一个多步骤、复杂且精确的过程，涉及多种因素、信号通路、调节因子的相互作用。越来越多的研究表明，胞葬作用受损在动脉粥样硬化斑块进展中起关键作用。现有研究认为动脉粥样硬化过程中胞葬作用缺陷的分子机制可能涉及: （1）吞噬细胞绝对数量减少和吞噬能力的下降，导致吞噬细胞的工作效率下降； （2）胞葬相关信号分子的紊乱，包括吞噬受体MerTK、LRP1 的脱落，凋亡细胞表面CD47 表达异常上调等；（3）动脉粥样硬化斑块组织局部大量凋亡及坏死细胞累积，释放多种促炎细胞因子，破坏胞葬信号途径，胞葬作用的失效会进一步引起继发性坏死、加剧炎症反应及自身免疫反应，从而在动脉粥样硬化的持续进展和胞葬受损之间形成恶性循环；（4）遗传因素，如9p21等位基因突变。目前已有多项针对增强胞葬作用的动脉粥样硬化干预研究在体外实验与小鼠模型上显示了初步成效，随着胞葬作用及相关信号通路的研究的不断深入，重新激活胞葬作用有望成为治疗动脉粥样硬化相关性疾病的新靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突