加味芎蝎散对咳嗽高敏综合征大鼠神经源性炎症的影响

孙洮玉,杨 斌,任军华,樊茂蓉,徐春英,郭慧娟

(1. 北京中医药大学东直门医院,北京 100700;2. 中国中医科学院西苑医院,北京 100091)

慢性咳嗽是指时间超过8周,影像学检查无明显异常的咳嗽[1]。咳嗽的病因复杂,涉及面广,治疗手段缺乏系统化及精准医学支持,有相当比例的咳嗽患者经抗生素及镇咳药治疗后收效甚微,并存在不良反应发生的可能,对患者心理、工作、学习等造成负面影响。咳嗽高敏综合征是针对慢性咳嗽诊治而提出的一个新概念,认为咳嗽并不总是与某种疾病关联,而是一种具有独特病理生理学过程的临床实体,疾病状况如哮喘、感染、食管反流等多数作为触发因素,而不是咳嗽的直接原因[2]。咳嗽受延髓呼吸中枢控制,大脑皮质起调节作用,咳嗽反射有自己的神经调节途径,速激肽网在呼吸道的广泛存在以及大脑皮质炎症介质的释放均是引发咳嗽反射的关键因素。气道的神经源性炎症是咳嗽高敏综合征发生的核心机制,气道上皮及气道平滑肌细胞表面存在大量速激肽受体,是神经源性介质作用的主要效应细胞,介导气道血管通透性增强、气道管腔分泌物增多,分泌炎症分子;咳嗽反射弧将信号传入咳嗽中枢,大脑皮质释放白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症介质,调节咳嗽反应的发生、持续[3]。加味芎蝎散是徐荣谦教授由传统古方芎蝎散加减而来,临床治疗咳嗽变异型哮喘疗效显著[4-5]。前期动物实验也发现,加味芎蝎散可以调节气道上皮增殖[6]、凋亡[7]、自噬[8]及Th1/Th2比例[9],逆转气道平滑肌表型转化[10],从而抑制咳嗽反应。本实验通过建立咳嗽高敏综合征大鼠模型,观察肺组织速激肽及受体、大脑皮质炎症介质等的表达变化,探讨了加味芎蝎散是否可影响神经源性炎症,以进一步明确其作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 36只SPF级雄性SD大鼠,体重(200±20)g,4～6周龄,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2016-0001。普通饲料喂养,自由饮水,保持室温(22±2)℃、湿度(50±10)%。本实验通过中国中医科学院西苑医院动物实验伦理研究委员会审核,伦理批准号:2021XLC015-1。

1.2药物 加味芎蝎散由川芎5 g、全蝎3 g、芦根20 g、荜茇1 g、半夏5 g、细辛1 g、五味子10 g、白前10 g组成,所有药材经北京中医药大学东直门医院孙洮玉副教授鉴定为正品。中药煎药机煎制,全蝎炮制入药,制成含生药量3.0 g/mL的浓缩液。磷酸可待因片(国药集团工业有限公司,国药准字H11020673,规格:30 mg/片)。

1.3试剂及仪器 红塔山过滤嘴香烟(焦油含量10 mg、尼古丁含量1.0 mg、CO含量10 mg),红塔烟草集团;P物质(SP)小鼠单克隆抗体(货号:ab14184)、瞬态电压感受器阳离子通道(TRPV1)小鼠单克隆抗体(货号:ab203103)、IL-6小鼠单克隆抗体(货号:ab9324)、TNF-α小鼠单克隆抗体(货号:ab220210),英国Abcam公司;降钙素基因相关肽(CGRP)兔单克隆抗体(货号:#14959)、IL-1β小鼠单克隆抗体(货号:#12242),美国CST公司;二抗酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(批号:1919D0516),北京中杉金桥生物技术有限公司;TPl020型全自动脱水机、RM2235型组织切片机,德国Leica公司;HI1220烤片机,德国Leica公司;BX53型光学显微镜,日本Olymplus公司。

1.4实验方法 随机选取6只大鼠作为正常组,剩余大鼠参照文献[11-12]实验方法进行咳嗽高敏综合征造模:每天于固定时间将大鼠放入自制的动物饲养敞箱(长40 cm、宽40 cm、高30 cm),箱子接近顶部同时点燃10支香烟,然后箱子上方盖上用来封闭的木板,60 min后取出大鼠,该场景用来模拟大鼠的被动吸烟状态,2次/d,持续2周后抽取大鼠行咳嗽反应检测,以确定是否造模成功。将造模成功大鼠随机分成模型组、加味芎蝎散高剂量组、加味芎蝎散中剂量组、加味芎蝎散低剂量组、磷酸可待因组,每组6只。按照大鼠/人体表面积法换算,加味芎蝎散高、中、低剂量组分别给予加味芎蝎散12 g/(kg·d)、6 g/(kg·d)、3 g/(kg·d)灌胃,磷酸可待因组给予磷酸可待因10 mg/(kg·d)灌胃,正常组及模型组给予等量蒸馏水灌胃,均1次/d,连续灌胃3周。

1.5检测指标及方法

1.5.1咳嗽次数 在灌胃1周、2周、3周末,分别将各组大鼠放入密闭箱内,雾化吸入浓度104 mol/L的辣椒素溶液,持续1 min,取出后记录3 min内的咳嗽次数。

1.5.2肺组织病理形态 末次灌胃结束后,以氯胺酮(3 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,颈椎脱臼法处死,迅速剖取左肺,置入10%中性福尔马林溶液中固定后,常规脱水、包埋、切片,HE染色,光学显微镜下观察。

1.5.3大脑皮质神经元细胞存活状态 取大鼠大脑组织,置入10%中性福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,4 μm切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精入水,常温下用0.1%尼氏染色液染色50 min,染色结束后流水洗涤、脱水、透明、封片,显微镜观察神经细胞染色情况(尼氏体是神经元的特征性结构之一,广泛存在于神经元的胞体和树突内,与碱性染料结合显示出蓝紫色,能反映细胞的存活状态)。

1.5.4支气管组织中SP、CGRP、TRPV1蛋白及大脑皮质中IL-6、IL-1β表达情况 采用免疫组化法检测:肺组织及脑组织石蜡切片脱蜡至水后,柠檬酸缓冲液(pH 6.0)高压修复抗原3 min,10% H2O2室温封闭10 min,PBS洗涤后加入一抗(浓度分别为1∶300,1∶200,1∶100,1∶200,1∶50,1∶200),用PBS代替一抗做阴性对照,4 ℃冰箱孵育过夜。次日PBS充分洗涤后,加入即用型二抗PV6000,室温孵育30 min,PBS冲洗,DAB显色,镜下观察目标细胞着色情况,自来水终止反应,充分洗涤后苏木精复染、盐酸酒精分化、氨水反蓝、梯度酒精脱水、封片。在光学显微镜下,每张切片选取3个高倍视野,医学图像分析软件(Image Pro-plus 6.0)分析测定每张图像的积分光密度值。

2 结 果

2.1各组大鼠咳嗽次数比较 实验过程中,正常组大鼠的咳嗽次数少且未见明显波动;模型组大鼠灌胃1周、2周、3周末的咳嗽次数均明显多于正常组(P均<0.05),且随时间迁移呈缓慢增多趋势;加味芎蝎散高、中剂量组及磷酸可待因组大鼠灌胃2周、3周末的咳嗽次数均明显少于模型组(P均<0.05),此3个给药组大鼠的咳嗽次数比较差异均无统计学意义(P均>0.05);加味芎蝎散低剂量组大鼠的咳嗽次数有减少,但与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠3 min内咳嗽次数比较次)

2.2各组大鼠肺组织病理形态比较 正常组大鼠支气管黏膜结构正常,上皮细胞未见变性,平滑肌排列有序,未见增厚,管壁未见炎细胞浸润;模型组大鼠支气管管腔扩张,黏膜上皮轻度变性,平滑肌层增生且排列无序,管壁充血、水肿,可见大量炎细胞浸润。与模型组比较,各药物组病变均有不同程度的减轻,其中加味芎蝎散组高、中剂量组黏膜上皮变性明显减轻,平滑肌组织排列较有序,炎细胞浸润减少;加味芎蝎散低剂量组与磷酸可待因组炎性反应明显减轻,黏膜上皮变性及平滑肌增生改变不明显。见图1。

图1 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠肺组织病理形态(HE染色,×200)

2.3各组大鼠大脑皮质神经元细胞存活状态比较正常组神经元细胞胞体形态正常,排列均匀,胞质丰盈,尼氏体明显;模型组神经元细胞部分分布稀疏,形态不规则,尼氏体变少;与模型组比较,各药物组细胞分布较密集,形态较规则,尼氏体增多,以加味芎蝎散组高、中剂量组和磷酸可待因组改善更明显。见图2。

图2 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠大脑皮质神经元细胞存活状态(尼氏染色,×200)

2.4各组大鼠支气管黏膜组织中SP、CGRP、TRPV1蛋白表达情况比较 SP、CGRP、TRPV1阳性表达呈黄色至棕黄色,主要表达在支气管黏膜上皮细胞胞浆及胞膜,部分间质神经纤维及血管内皮细胞上亦有表达,本次实验仅统计黏膜上皮部分。模型组大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表达积分光密度值均明显高于正常组(P均<0.05),加味芎蝎散组高、中剂量组大鼠黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1蛋白表达积分光密度值均明显低于模型组(P均<0.05)。见图3～5及表2。

图3 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠支气管组织中SP蛋白表达情况(免疫组化染色,×200)

图4 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠支气管组织中CGRP蛋白表达情况(免疫组化染色,×200)

图5 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠支气管组织中TRPV1蛋白表达情况(免疫组化染色,×200)

表2 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠支气管组织中SP、CGRP及TRPV1蛋白表达积分光密度值比较

2.5各组大鼠大脑皮质中IL-6、IL-1β表达情况比较 IL-6、IL-1β表达在神经细胞胞浆,为黄棕色颗粒状。模型组大鼠大脑皮质中IL-6、IL-1β表达积分光密度值均明显高于正常组(P均<0.05),各药物组大鼠大脑皮质中IL-6、IL-1β表达积分光密度值均明显低于模型组(P均<0.05)。见图6、图7及表3。

图6 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠大脑皮质中IL-6表达情况(免疫组化染色,×200)

图7 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠大脑皮质中IL-1β表达情况(免疫组化染色,×200)

表3 正常组和咳嗽高敏综合征各组大鼠大脑皮质中IL-6、IL-1β表达积分光密度值比较

3 讨 论

咳嗽是呼吸系统重要的防御机制,可以及时清除气道分泌及呼吸道异物;当其功能失调时,表现为咳嗽不可抗拒的发作,甚至对轻微的环境刺激都产生高敏反应。咳嗽已经成为全球普遍存在的医学问题,亚太国家的一项调查显示,约10%的成年人被咳嗽困扰,老年人所占比重较大[13]。一项针对老年人的调查发现,慢性持续性咳嗽对精神健康的影响与中风或帕金森病相当[14]。尽管对慢性咳嗽有细致的诊疗方案,但仍有12%～42%的患者无法解释病因或难以治愈。此外,缺乏有效和安全的治疗咳嗽药物,欧洲进行的一项调查研究显示,慢性咳嗽患者止咳药治疗有效率仅为57%,而无效率达到36%[15],这一数据也说明在治疗咳嗽方面需要寻求更为有效的治疗药物和治疗策略。

咳嗽高敏综合征概念来源于2014年7月在伦敦举行的第八届国际咳嗽会议。传统观点认为,咳嗽依托于疾病,通常与其病因密切相关。而咳嗽高敏综合征概念的基础是咳嗽神经通路,认为疾病仅仅起到触发作用,而不是咳嗽的直接原因,强调咳嗽反射通过外周神经和中枢神经共同调控保持平衡,外周刺激信号主要通过迷走神经介导,而大脑中枢在咳嗽反射调控过程中发挥着更重要的作用[16]。

辣椒素是辣椒的有效成分,可引起机体疼痛、烧灼感以及咳嗽,研究中一般作为咳嗽的诱发剂。TRPV1是辣椒素的受体,广泛存在于气道壁感觉神经元、气道平滑肌和支气管黏膜上皮细胞中,其在慢性咳嗽患者中表达增加[17]。最近的一项临床试验探讨了TRPV1拮抗剂SB-705498对辣椒素诱导咳嗽反应的影响,发现尽管TRPV1拮抗剂可以降低咳嗽反射对辣椒素的敏感性,但是24 h咳嗽次数、患者自评咳嗽严重程度、咳嗽冲动和咳嗽特异性生活质量相对于安慰剂组未见明显差异[18]。神经源性炎症过程需要神经递质介导,SP和CGRP是具有多种生物活性的速激肽,二者可通过刺激感觉神经末梢介导神经源性炎症发生,引起钙内流、支气管平滑肌收缩、气道上皮损伤、黏液分泌及血管通透性增加、血浆渗出等多种生物学表现[19-20]。白细胞介素参与机体的炎症反应、信息传递、免疫细胞激活以及介导淋巴细胞增殖和分化等多种作用,IL-6和IL-1β是白细胞介素家族中介导中枢神经炎症的主要促炎分子,据研究多种中药或其有效成分可降低IL-6、IL-1β水平,增加皮质神经元数量,减轻神经损伤[21-23]。本实验结果显示,模型组大鼠出现了病理组织结构性损伤,上皮变性,平滑肌层增生、紊乱,且伴有炎细胞浸润等;大脑皮质神经元细胞中尼氏体变少;支气管黏膜上皮中SP、CGRP、TRPV1和大脑皮质中IL-6、IL-1β表达上调。提示烟熏建立的咳嗽高敏综合征模型可引发脑组织的功能性损伤,这可能与神经炎症有关,但目前未见到有关咳嗽与脑组织关系的报道,其深层机制有待进一步探索。

中医学认为咳嗽属于“久咳”“顽咳”范畴。《黄帝内经》提出“五脏六腑皆令人咳,非独肺也”,认为咳嗽作为症状,与其他脏器的功能障碍有密切联系。中医既往对咳嗽辨证分型较多,现删繁就简,一般分为外感咳嗽和内伤咳嗽两大类,其病因病机多为外邪所伤,脏腑虚损等而致祛邪不尽,留伏于内,成为伏邪,复因外邪引动,内外合邪,肺气上逆而作咳嗽[24]。芎蝎散源自宋代陈文中《小儿病源方论》的家传累世名方,原方为川芎、荜茇各1两,蝎稍去毒尖1钱,细辛、半夏各2钱。加味芎蝎散是在前人基础上加白前、五味子、芦根等药而成方,方中川芎活血行气、祛风止咳;全蝎搜风通络,以散肺风;配合细辛、荜茇、半夏温肺化痰止咳;白前降气止咳;五味子敛肺止咳;芦根清肺止咳。该方在临床使用中疗效确切,不良反应率低。本实验结果显示,与模型组比较,加味芎蝎散高、中剂量组大鼠咳嗽次数明显减少,病理变化均有不同程度的减轻,支气管组织中SP、CGRP、TRPV1和大脑皮质中IL-6、IL-1β表达积分光密度值均明显降低。证实加味芎蝎散方可以减少咳嗽高敏综合征大鼠的咳嗽次数,减轻肺组织炎症,保护脑神经元,下调神经源性炎症因子表达。

综上所述,加味芎蝎散方可以抑制咳嗽高敏综合征大鼠的咳嗽反射,减轻肺组织和脑神经元损伤,其作用机制可能与抑制神经源性炎症有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。