miRNA 在糖尿病足溃疡炎症期的作用机制及中医药干预进展

赵欣华，张东旭，高献敏，于文慧，张美君，赵 钢

糖尿病是一种临床常见的慢性、代谢性疾病，常使多器官功能受损，导致多种并发症，糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer, DFU）是临床中最常见的并发症[1]。DFU 常因患者局部缺血、神经病变、感染等因素，由外伤、压力性损伤等诱发，出现踝关节远端皮肤及深部组织的溃烂。DFU 具有经久不愈，愈后易复发，较高致残率的特点，给患者生理及心理带来极大的负担，严重影响了患者的生活质量，故对于DFU 的治疗至关重要。目前，对于DFU 的研究已逐渐步入基因层面，越来越多的研究表明，非编码小RNA （microribonucleic acid，miRNA）在DFU 皮肤中异常表达，并参与了DFU 的发生发展，对于miRNA 的调控可能成为DFU 治疗的关键。本文通过miRNA 在DFU 炎症期中的作用机制，以及中医药通过调控miRNA 治疗DFU 研究进展的综述，以期为中医药治疗DFU 提供基因层面的理论支持。

1 miRNA 的发生机制

miRNA 即microRNA，又称微小核糖核酸。其为内源性长度为20～24 nt 的非编码单链RNA 分子，存在于真核生物体内。在细胞核内存在的miRNA 的前体（pri-miRNA)可被加工成茎环或发夹结构前体miRNA (pre-miRNA)，经过转运，premiRNA 由细胞核移动到细胞质，在这里被加工成miRNA，而人类近1/3 的基因都受这些miRNA 调控[2-3]。miRNA 在GW182 功能蛋白的调控下抑制靶向目标mRNA 的翻译过程，破坏mRNA 的自身稳定性，进而负调控转录后的基因表达水平，即miRNA 在细胞质中对基因表达进行负调控[4-5]。细胞质内的miRNA 还可以通过以下多种途径调控生命活动，包括：直接参与调节基因转录过程、靶向线粒体基因、与多种功能蛋白结合及促进靶向mRNA 表达作用[2]。

2 miRNA 在糖尿病足溃疡炎症期的作用机制

DFU 患者创面的愈合是一个由多种细胞及组织因子参与的复杂的生理过程，主要包括炎症期、增殖期与重塑期3 个时期，3 个时期相辅相成，任何一个愈合过程反应不及或过度都有可能造成愈合创面的再度损伤[6]。创面最先进入的时期为炎症反应期，这一时期对于创面愈合起重要作用。炎症反应期发挥作用的主要有两种因子：抗炎因子和促炎因子。促炎因子的分泌加速了炎症过程，而抗炎因子则可减缓炎症的发生。两类炎症因子处于相对平衡状态，才有利于创面的修复。若促炎因子生成过多，则会导致创面迁延不愈，从而形成慢性溃疡[7]。若抗炎因子生成过多，同样对于创面愈合不利。研究发现，miRNA 在愈合过程的炎症期发挥了重要作用。DFU 后巨噬细胞被激活，M1 型巨噬细胞可促使大量促炎因子生成，M2 型巨噬细胞则可促使抗炎因子表达，miRNA 靶向多种转录因子来调控巨噬细胞的极化，从而调节炎症过程。

2.1 miRNA -155 miRNA -155 作为多功能miRNA，参与了多种生物学过程，且与炎症密切相关。Cai 等[8]研究表明，miRNA-155 能够调节巨噬细胞的极化状态，在巨噬细胞由抗炎型M2 型向促炎型M1 型极化时高表达，而在M1 型向M2 型极化时低表达。同样的，Li 等[9]研究也表明，miRNA-155 的缺乏可导致巨噬细胞的M1-M2 极化。有团队研究表明，miRNA-155 通过调控转录因子C/EBP-β、SHIP1 和IL13Rα1 促进M1 巨噬细胞的极化[10]。而Jin 等[11]研究表明，miRNA-155 的过表达直接促进了促炎细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-α 和白细胞介素（IL）-1β 的产生，加重了炎症状态。谭仕廉等[12]研究发现也同样佐证了这一结论，miRNA-155 可通过靶向抑制SOCS1 蛋白表达，促进LPS 所致的THP-1 巨噬细胞的激活，释放炎性细胞因子TNF-α及IL-8，从而促进炎症反应。而TNF-α 作为被激活的巨噬细胞最先产生的细胞因子，又会诱导IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 等细胞因子的分泌，从而产生连续反应，更大程度加速炎症反应的发生[13]。细胞实验表明miRNA-155 可通过靶向IL-13 受体α1的表达水平，介导STAT6 的激活减弱，从而抑制M2型巨噬细胞生成，加速炎症反应的进程；此外，研究人员还发现miRNA-155 对IL-13 依赖性调节的巨噬细胞M2/pro-Th2 表型建立相关基因（SOCS1、DC-SIGN、CCL18、CD23 和SERPINE）的影响，可能也是其抑制巨噬细胞向M2 型极化的重要机制[14]。

2.2 miRNA-9 miRNA-9 是一种富集在脑内的miRNA，既往研究多集中在其对神经系统的影响，而miRNA-9 在炎症过程中也发挥了重要作用。miRNA-9 可通过调节核因子（NF）-κB 水平，抑制巨噬细胞释放炎性细胞因子。NF-κB 是一种异聚转录因子,可通过介导激活促炎因子，从而调控TNFα、IL-1β 和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等的生成[15]。体外实验发现，miRNA-9 过表达可减少RAW 264.7细胞释放炎性因子TNF-α 和IL-1β，促进PPARs活化，调控M1/M2 极化状态，降低炎性反应状态[16]。吴晓玲等[17]研究发现，抑制miRNA-9 可下调PPARδ 的表达，减少抗炎转录因子BCL-6 的生成，从而促进巨噬细胞M1 极化。细胞实验表明，在OGD 模型中NF-κB、TNF-α、IL-1β 和iNOS 等炎性因子均处于高表达状态，而将miRNA-9 转染入细胞后，上述炎性因子表达降低，提示miRNA-9 可抑制上述炎性因子的表达[18]。同样的，Bazzoni 等[19]及Qian 等[20]研究也证实miRNA-9 可通过抑制NF-κB下调TNF-α 和IL-1β 的表达，从而减轻炎症反应。这些研究提示miRNA-9 可能是通过作用于关键靶点NF-κB 来治疗DFU。

2.3 miRNA-146a 多项研究结果表明miRNA-146a 在炎症反应过程中起重要的调控作用[16-18]。细胞实验表明，miRNA-146a 可通过抑制IRAK1 和TRAF6 表达，降低JNK 磷酸化水平，减少巨噬细胞M1 型极化，抑制TNF-α、IL-1β 和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的生成，从而降低炎症反应[19]。Qian等[20]研究证实了miRNA-146a 可通过下调Notch1的表达使M1 型巨噬细胞的激活被抑制，还可以提高PPARγ 的表达增强M2 巨噬细胞的活化，以此发挥抗炎作用。miRNA-146a 还能够直接抑制炎性因子在细胞中的表达，从而显著降低炎症反应水平。研究表明，miRNA-146a 能够直接抑制细胞中多种白细胞介素因子的表达，包括IL-6、8、17、13、1β等，从而直接抑制细胞炎症反应[21-22]。miRNA-146a还能够通过TLR 途径负反馈调节促炎性细胞因子的表达，从而抑制侵袭性炎症的产生，阻止炎症进展[23]。动物实验表明，随着大鼠体内miRNA-146a 的分泌不断增多，细胞因子IL-6、MCP-1 及TNF-α 的分泌明显被抑制[24]。细胞实验则证实，miRNA-146a的过表达直接抑制Nox4 的分泌，减少ROS 的产生从而降低氧化应激水平，抑制炎症的发生[25]。这些研究都表明miRNA-146a 能够通过多条途径负向调节炎症反应，提示miRNA-146a 具有治疗DFU 的重大潜力。

上述研究表明，miRNA 在DFU 炎症期的异常表达发挥着重要的调节作用，这为炎症期DFU 的治疗提供了重要参考。miRNA 通过多种途径调控巨噬细胞表型，平衡促炎因子与抗炎因子在创面的表达，从而减轻创面炎症状态，避免过度炎症反应，保护创面，促使创面顺利进入下一修复期。

3 中医药通过调节miRNA 干预糖尿病足溃疡

中医药治疗DFU 的疗效显著、历史悠久，治疗疾病具有多层次、全方位、多靶点共同作用的特点。近年来，大量研究结果表明，中药单体提取物、中药组成成分及中药复方均能够通过调控miRNA 来影响DFU 进程。

3.1 中药单体及提取物 中药单体及提取物是从单味中药中提取的有效化学成分，由现代医学与祖国传统医学融合而成。相较于中药复方，其成分单一、化学结构明确，便于进行安全性及有效性评价。研究发现三七总皂苷、黄芪总皂苷、人参皂苷、葛根素、龙血素、山奈酚、黄芩苷等多种中药单体及提取物可通过调节miRNA 治疗DFU。

五加科植物三七具有化瘀止血、活血定痛功效，豆科植物黄芪具有健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌等多重功效，二者的提取物三七总皂苷及黄芪总皂苷能够通过上调miRNA-146a的表达,活化IRAKl 和TRAF6，抑制TLR 信号通路，降低炎症反应的发生，改善创面微循环，从而加速创面修复[26]。这与此前论述一致[23]，此外动物实验还表明，三七花总皂苷水凝胶能够促进肉芽组织的形成，增强对炎性渗出物的吸收，从而加速大鼠皮肤创面修复[27]。Xue 等[28]研究表明，人参提取物人参皂苷Rg1 通过miRNA-2113/RP11-982M15.8/Zeb1 通路调控降低高糖诱导的间充质活化和组织纤维化。人参皂苷Rg1 还可通过抑制miRNA-489e3p 的表达，负调控Sirt1，激活PI3K/AKT/eNOS 信号，增强eNOS 和iNOS 的表达，促进NO 的产生和血管生成，加速伤口愈合[29]。Xu 等[30]研究发现，豆科植物葛根主要成分葛根素通过上调miRNA-145-5p 表达水平，抑制TLR4/MyD88/NF-κB（p65）通路的激活，降低多种炎性因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等的表达，从而减少炎症反应的发生，促进创面愈合。血竭作为血管外科常用中药，能够活血定痛，化瘀止血，生肌敛疮，主要成分龙血素A 抑制miRNA-339-5p的表达，增加了同源异形盒基因5 的表达，从而激活了Wnt 信号通路，促进细胞增殖与分化，从而修复创面[31]。当归补血复合微囊由当归主要成分阿魏酸及黄芪主要成分黄芪甲苷复合而成，体外实验结果表明，20 μg/mL 当归补血复合微囊能够上调miRNA-21 的表达，通过JAK2/STAT3 信号通路促进血管生成，加速创面愈合[32]。姜科植物姜黄具有破血、行气止痛的作用，其主要成分姜黄素具有抗炎、抗氧化及抗癌多种作用。Qiu 等[33]研究结果表明，姜黄素能够上调miRNA-143 和miRNA-124 的水平，降低靶基因NF-κB、ROCK1 及因子TLR9 的分泌，以此降低炎症水平。中药肉桂的提取物桂皮醛能够显著抑制TLR4、NO、MMP-13 等炎性因子的分泌，当其与miRNA-146a 模拟剂联合使用时，其抑制效果更为显著，而当其与miRNA-146a 抑制剂联合使用时，抗炎作用明显降低，这提示桂皮醛可能通过协同miRNA-146a 发挥抗炎作用[34]。毛茛科植物芍药提取物芍药内酯苷能够促进miRNA-149-5p 的表达，从而抑制WISP1 表达，减低IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平，抑制细胞凋亡，改善创面环境[35]。连翘及山奈提取物山奈酚属于黄酮类化合物，其通过上调miRNA-130a 调控STAT3 水平，降低细胞内炎性因子的分泌，抑制细胞凋亡[36]。同属于黄酮类化合物的黄芩苷，主要来源于中药黄芩，细胞实验表明，黄芩苷能够促进IL-1β 处理过的细胞中miRNA-766-3p 的表达，并且抑制细胞凋亡，促进ECM 的合成[37]，这可能加速了创面的愈合。

3.2 中药复方 中药复方是包含两种或两种以上药物的方剂，依据君臣佐使的组方原则，针对某一证型的疾病进行配伍使用。中药复方是祖国传统医学的精髓，通过多种药物的配伍使用，有着同病异治、异病同治的功效，多种药物通过联合应用，既可以增强药效，又能够减轻药物不良反应，有着良好的治疗效果。相比于中药单体及提取物，中药复方成分复杂，研究难度较高，通过调节miRNA 来治疗DFU 的中药复方主要有生肌玉红膏、回阳生肌方和紫朱软膏。

生肌玉红膏是治疗创面的常用方剂，主要成分是白芷、甘草、归身等，有活血祛腐、解毒生肌的功效。体外实验表明，生肌玉红胶原可以通过调控脂肪干细胞来促进miRNA-21 的表达，并且这种表达呈剂量依赖性，高表达的miRNA-21 可能促进下游p-p38 蛋白表达的增加，从而促进血管新生，加速血液流通及创面愈合[38]。回阳生肌方由人参15 g，鹿茸15 g，雄黄1.5 g，乳香30 g，琥珀7.5 g 及京红粉3 g组成，功能主治为回阳生肌,止痛收敛。高通量测序分析显示，回阳生肌方应用于创面的LncRNA 及mRNA 可能通过调节PPAR、局灶性黏附及内吞作用等信号通路参与创面愈合的调控[39]。紫朱软膏是临床治疗DFU 的常用方剂，是在奚九一先生“煨脓长肉膏”方义上化裁而来，包含朱砂、紫草、冰片、黄芪、龙血竭及阿胶六味中药。李文惠等[40]应用高通量测序方法分析发现，DFU 大鼠在紫朱软膏治疗前后，存在122 种miRNAs 差异表达，用药后下调差异显著性最大的5 种为miR-379-3p、miR-496-3p、miR-434-5p、miR-411-5p、miR-122-5p，上调差异显著性最大的5 种为miR-1b、miR-1-3p、miR-133b-3p、miR-133a-3p、miR-133a-5p，这一研究结果为紫朱软膏干预糖尿病溃疡的治疗提出了基因层面上的可能途径。

4 结语

据统计，约有1/4 的糖尿病患者最终发展为DFU[41]。较高的发病风险及发病率严重影响了个人、家庭及社会。早期的预防、诊断与治疗能够大大改善DFU 患者的症状，降低发病率及截肢率。近年来，随着基因组学的深入发展，miRNA 参与调控DFU取得了较大进展。本文分别探讨了miRNA-155、miRNA-9 及miRNA-146a 三种常见的miRNA 在DFU 炎症期的作用机制，以及多种中药单体及提取物、中药复方通过上调或下调不同miRNA 来实现对DFU 的有效干预，从而达到治疗目的。这些研究为中医药治疗DFU 提供了基因层面的理论依据，虽然中医药通过调控miRNA 治疗DFU 的疗效肯定，但由于其多成分、多靶点的作用特点，治疗机制并未完全清晰，尤其是中药复方的相关研究较少，研究层面不够深入，且仅有少数miRNA 应用于临床。未来期冀科研工作者们运用更多新技术，继续探索中药单体及复方，为中医药调控miRNA 应用于临床治疗提供更多方案。