细胞焦亡与代谢相关脂肪性肝病发展的相关性及治疗机制研究进展

洪文文 张若梅 谭善忠

细胞焦亡是一种相对新型的非凋亡性细胞程序性死亡方式,属于机体免疫形式之一。近些年来,细胞焦亡相继被发现参与多种疾病的发生、发展。代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)因其高发病率目前已成为全球医疗系统巨大负担,亟待开发出特效药物。多项研究证实,细胞焦亡在MAFLD的进展过程中扮演重要角色,可多层面、多环节推动MAFLD进程。本文就细胞焦亡在MAFLD发展中的作用及目前治疗机制研究现状进行综述。

一、细胞焦亡

细胞焦亡(pyroptosis),又称细胞炎性坏死,是一种由Gasdermin(GSDM)家族介导的程序性细胞死亡。特定的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)家族成员在被特异性炎症小体激发后,对GSDMD进行切割,使其释放出 GSDMD-N结构域,该结构域随后与细胞膜膜脂结合,形成膜孔,最终导致细胞胀大破裂死亡。细胞焦亡属于先天性免疫的一种,焦亡的过程是通过细胞的自我裂解,实现清除炎症的目的。细胞焦亡形态特征包括离子内流、细胞肿胀、膜孔形成、线粒体去极化、膜破裂等,且在过程中释放白细胞介素(IL)-1b、IL-18等胞质内容物[1]。然而,过度激活的焦亡可引发/加重组织病理性炎症。近年来多项研究已证实,细胞焦亡广泛参与临床各种感染性疾病、神经系统疾病、心血管疾病、免疫系统疾病等[2-4]。

二、MAFLD

MAFLD旧称非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),是指以肝细胞内脂质过量沉积为主要特征,同时合并肥胖或代谢功能障碍的一组慢性肝病综合征。MAFLD的定义更新于2020年,由来自22个国家的国际专家小组提议并就诊断标准达成共识[5]。MAFLD患病率在全球范围内激增。2017—2018年美国MAFLD的患病率为39.1%,其中约7.4%的MAFLD患者患有晚期肝纤维化[6]。肝纤维化程度是MAFLD患者重要的预后因素,MAFLD患者的全因病死率及肝脏相关病死率均与纤维化分期呈正相关[7]。同时,MAFLD患者群体具有更高的糖尿病、心血管疾病风险[8]。在MAFLD的管理方面,亚太肝病研究协会仍首推优化生活方式,包括减重、优化饮食结构、运动干预等[9]。截至目前,尚无由FDA批准的关于MAFLD的特定治疗药物[10]。在对MAFLD病机研究中发现,细胞焦亡在“单纯性脂肪肝—非酒精性脂肪性肝炎(NASH)—肝硬化”发展过程中扮演不容忽视的角色[11]。

三、细胞焦亡与MAFLD进展的相关性

(一) MAFLD发病及进展的病理机制 MAFLD分为良性的单纯非酒精性脂肪肝(NAFL)和NASH。后者是在前者肝脏5%以上肝细胞存在脂肪变性的基础上,出现不同程度的肝小叶炎症及肝纤维化。传统理念中MAFLD病理进展路径为“NASH—肝纤维化—肝硬化—肝癌”。主流的致病机制仍遵循“三次打击”学说:①肝细胞内脂质沉积;②脂肪酸介导脂毒性物质生成诱发肝细胞死亡;③肝内外炎症发生及肝纤维化形成。病理过程涉及内质网应激、线粒体功能障碍、肝小叶及门静脉炎症、肝细胞程序性死亡/坏死、肝细胞外基质积累等[12]。

代谢底物(主要是单糖葡萄糖、果糖)超负荷是脂肪肝发病的病理基础。过量的底物转化为过量的游离脂肪酸,肝细胞内脂肪酸一部分经线粒体氧化,一部分再酯化成为甘油三酯输送至血液或再次回到肝脏游离脂肪酸池。当脂肪酸底物过载和(或)代谢途径受损时,可刺激产生二酰基甘油、神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱等脂毒性物质,导致以内质网应激、线粒体功能障碍为主的细胞器功能衰竭,诱发肝细胞氧化应激,同时活化炎症小体,共同导致肝细胞死亡。同时,细胞内脂质沉积可诱发胰岛素抵抗,导致机体整体代谢环境恶化,加重肝脏损伤,并诱导肝外代谢性疾病、心脑血管疾病的发生、发展。

近些年有关MAFLD发病机制的研究呈井喷式增长,结果均证明MAFLD的致病、进展受多因素驱动。除了公认的环境危险因素(包括饮食、运动习惯等)、遗传因素外,肝脏与其他器官(脂肪组织、肠道菌群)之间的相互作用也是导致MAFLD进展个体异质性的重要原因[13, 14]。关于肝纤维化的进展,尽管此前有项基于肝脏穿刺活检开展的研究,结果指向NAFL、NASH群体表现出纤维化进展的患者数量比例没有显著差异,但NASH患者的纤维化进展速度显然较NAFL患者更快[15, 16]。NASH的演变和进展是受众多因素影响的复杂事件,它最终导致了肝星状细胞(HSC)的活化,造成细胞外基质的过度合成、沉积[17]。NASH与肝硬化和肝细胞癌发生的高风险有关,炎症无疑是促进肝纤维化发生的重要因素[18]。

(二)细胞焦亡参与并促进肝脏炎症及肝纤维化 细胞焦亡属于机体免疫方式之一,细胞裂解的初衷旨在缓解病原体导致的炎症。GSDMD是焦亡的执行者,目前研究发现能够切割GSDM蛋白引发细胞焦亡的含半胱氨酸的Caspase家族成员包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5,以及小鼠同源蛋白Caspase-11。根据切割GSDMD蛋白的上游蛋白不同,可将细胞焦亡发生通路分为以下两种途径。①Caspase-1依赖途径:在病原体、细菌等信号的刺激下,细胞内的炎症小体识别信号,Pro-Caspase-1与衔接蛋白ASC结合,激活Caspase-1,活化的Caspase-1一方面切割GSDMD,形成GSDMD氮端和碳端,GSDMD-N和细胞膜上的磷脂蛋白结合形成孔洞,释放内容物,诱导焦亡发生;同时活化的Caspase-1对pro-IL-1β、pro-IL-18进行切割,形成IL-1β和IL-18,并释放到胞外,造成炎症反应。②Caspase-4/Caspase-5、Caspase-11(鼠)依赖途径:炎性刺激因子没有通过受体直接进入细胞质内,Caspase-4/Caspase-5、Caspase-11(鼠)被活化,对GSDMD 进行切割,诱导焦亡发生;同时,Caspase-4/Caspase-5、Caspase-11诱导Caspase-1活化,对IL-1β和IL-18的前体进行切割、释放,造成细胞外炎症反应[19, 20]。

多项研究表明,在NASH患者及NASH实验动物模型中,与细胞焦亡相关的通路蛋白表达、炎症因子高于正常水平。Caspase-1在患者的肝脏和血清中增加,且上升水平与NASH的严重程度和纤维化阶段相关[21]。另一项研究发现,与健康肝组织相比,MAFLD/NASH患者肝脏中GSDMD和GSDMD-N蛋白水平升高。同时,与MAFLD患者相比,NASH患者的GSDMD-N水平显著升高,且与纤维化和MAFLD活动评分呈正相关[22]。在实验动物模型中研究发现,野生Caspase-11基因缺乏小鼠体内GSDMD、Caspase-1和成熟IL-1β的蛋白质水平亦降低,伴随MCS饮食诱导的小鼠肝脏脂肪性变、肝内外炎症和肝纤维化程度的降低;证实了Caspase-11介导的肝细胞焦亡亦促进 NASH 的进展,且Caspase-11的过度表达可能导致了NASH小鼠更严重的肝脏病变[23]。细胞焦亡参与并促进肝脏炎症及纤维化这一事实是明确的,鉴于MAFLD具有复杂的发病机制,焦亡对MAFLD的影响也相继在多个、不同的病理环节被发现。

细胞焦亡直接参与肝脏炎症及后续的肝纤维化:细胞焦亡发生的两个通路,尤其是Caspase-1介导的经典通路,依赖不同炎症小体的介导。焦亡的底物均是GSDMD-N结构域。来自空军军医大学的徐冰团队,通过对临床45名招募者肝组织检测并对比,结果证实GSDMD-N蛋白水平在NAFLD/NASH患者肝组织中上调,且GSDMD-N蛋白水平与肝小叶炎症及肝细胞气球样变程度呈正相关。该团队还通过动物实验证实,在同样MCD饮食诱导下,GSDMD基因缺乏小鼠肝脏炎症细胞浸润均较野生小鼠明显减轻。GSDMD可促进IL-1β、TNF-α、MCP-1分泌,持续激活Nf-κB 信号通路引发炎症及巨噬细胞募集。同时该研究还发现在MCD诱导的脂肪性肝炎中,GSDMD促进肝营养性纤维化进展[22]。

目前研究发现的可介导细胞焦亡的几种炎症小体有NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin等[24]。GAUL S等证明了原代小鼠和人肝细胞在NLRP3炎症小体激活后发生细胞焦亡,并释放NLRP3炎症小体蛋白。肝星状细胞吞噬细胞外NLRP3炎症小体颗粒后,在分泌IL-1β的同时,诱发α-平滑肌肌动蛋白表达,直接导致肝损伤和纤维化的发生[21]。高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏中AIM2炎性体相关蛋白质水平,以及血清中IL-1β和IL-18水平升高,而抑制AIM2炎性小体激活可抑制NAFLD小鼠肝细胞焦亡、缓解肝脏炎症[25]。Eun Hee Koh等证实游离胆固醇可诱导肝细胞中SMS1表达,敲除Sms1后,高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠肝细胞上清液中乳酸脱氢酶、GSDMD-N含量均降低。具体机制推测为由SMS1活化蛋白激酶Cδ(PKCδ)和NLR家族CARD结构域蛋白4(NLRC4)炎性小体产生的二酰基甘油(DAG),诱导了肝细胞焦亡,加重肝脏炎症[26]。一项体外细胞培养实验发现,TNF-α的增加促进了NLRC4炎症小体的激活,继而增加IL-18和IL-1β的产生,促进非酒精性脂肪性肝病的炎症反应[27]。膜联蛋白A2(ANXA2)通过经典Caspase-1通路诱导焦亡,加重NASH小鼠的肝脏炎症及肝纤维化[28]。

细胞焦亡可通过影响机体代谢环境间接影响MAFLD进程:胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是MAFLD发病核心病理机制之一,也是引发肝外代谢性疾病的主要原因。胰腺组织的细胞焦亡与糖尿病的发生联系密切,发生于胰腺外的细胞焦亡也可通过提高脂肪组织、骨骼肌、血清等焦亡相关分子的表达,间接诱发胰岛素抵抗。有研究发现,通过高脂饮食喂养诱导的肥胖小鼠脂肪组织中Caspase-1、ASC、NLRP3、IL-1β、GSDMD的mRNA表达水平增加,脂肪组织的胰岛素敏感性降低,同时体外细胞实验证实胰岛素抵抗的发生与NLRP3激发的脂肪组织细胞焦亡相关[29]。IL-1β可刺激免疫细胞增殖,造成胰岛吞噬细胞浸润,损伤胰岛功能[30]。机制研究发现IL-1β可能通过减少胰岛素受体底物-1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化,负调节IRS-1基因表达,直接抑制胰岛素信号通路,诱导胰岛素抵抗[31]。对2型糖尿病患者使用IL-1β受体拮抗剂可其血糖水平和胰岛分泌功能[32]。NLRP3炎症小体激活IL-1β途径是诱发IR的重要机制之一[33]。

IL-18的生理作用受细胞因子和免疫环境的共同影响。NLRP-1炎症小体刺激状态下产生的IL-18可通过影响脂肪分解和胰岛素敏感性对机体代谢产生正面调控作用[34]。然而,同样有研究发现糖尿病患者IL-18循环水平升高,这种病理状态下IL-18主要是NLRP3激活的产物[35, 36]。故细胞焦亡过程中的NLRP3/IL-18轴可能是胰岛素抵抗发生的促进因素之一。

细胞焦亡可能加重肝细胞脂肪变性:肝细胞脂肪变性是MAFLD发病机制中第一次打击及病理基础。海军军医大学的徐冰团队同样发现,GSDMD缺乏小鼠成脂基因Srebp1c(Srebf1)的表达减少,脂解基因,包括Pparα、Aco (Klk15)、Lcad(Acadl)、Cyp4a10、Cyp4a14的表达上调,使GSDMD缺乏表现出较低的脂肪变性[22]。推测肝细胞焦亡可能加重肝细胞脂肪变性,具体机制尚不明确。

四、治疗机制探索

细胞焦亡参与MAFLD病程进展目前已明确,故细胞焦亡可作为我们延缓MAFLD进展的治疗措施之一。已有许多动物实验研究证实可通过干预细胞焦亡途径治疗脂肪肝。干预措施包括降糖药物、植物来源化合物、中药复方制剂等[37-40]。研究靶点以由NLRP3介导的炎症通道为主。

NLRP3炎症小体是诱导细胞焦亡的重要介质之一。近期的一篇综述总结了包括31种植物来源活性成分(包括萜类、黄酮、生物碱和酚类等),通过NLRP3炎性小体途径调控细胞焦亡,从而减轻非酒精性脂肪肝模型脂质沉积及肝脏炎症程度[38]。而影响NLRP3炎性小体的上游信号各有不同。线粒体衍生的活性氧是激活NLRP3炎性小体的重要信号之一,研究发现利拉鲁肽可通过诱导肝细胞线粒体自噬,抑制部分NLRP3炎性小体的激活,减少肝细胞焦亡[37]。一项动物实验表明芒果苷可通过调控AMPK信号通路,抑制NLRP3炎症小体活化,减轻小鼠肝细胞焦亡;实验组用体外实验证实除缓解肝损伤外,芒果苷同时还可促进细胞内葡萄糖消耗,减轻胰岛素抵抗[41]。黄芩苷能够通过调节NRF2 / HO-1 / NRLP3途径减轻NASH小鼠肝细胞焦亡[42, 43]。一种来源于牛樟芝的三萜类化合物(Antcin A),可通过NLRP3炎性小体途径抑制肝巨噬细胞的焦亡[44]。紫衫叶素可通过抑制P2X7R(介导微生物进入细胞从而激活NLRP3的受体之一)表达,抑制脂肪肝小鼠肝细胞Caspase-1依赖经典途径细胞焦亡[45]。经典化合物小檗碱,可能通过 ROS/TXNIP 轴抑制NLRP3炎症小体活化来实现延缓NASH的进展[46]。中药复方“丹参泽泻汤”可能通过上调Nrf2水平,抑制ROS / NLRP3/ IL-1β轴系列信号表达,抑制肝细胞焦亡,缓解非酒精性脂肪肝大鼠肝脏炎症[47]。栀子苷可能通过CTCF/DPP4信号通路抑制Caspase-1介导的肝细胞焦亡[48]。Dieckol,来源于韩国的海带提取物,被证实可减少高脂饮食饲养小鼠肝脏中的NLRP3炎症小体表达,减轻肝细胞焦亡,同时抑制肝脏脂肪生成并增加脂肪分解,但后者脂肪代谢的调控是否与细胞焦亡存在因果关系,此课题未作研究[49]。此外,雌激素受体α、维生素D均被证实可通过靶向NLRP3-GSDMD轴介导的肝细胞焦亡来干预MAFLD[50, 51]。

除以NLRP3炎性小体为核心的通路外,其他许多通路也可作为潜在干预靶点。蓝莓的主要单体之一TEC,可通过上调tRF-47表达,激活NASH模型小鼠肝细胞自噬,从而抑制焦亡发生、减少炎症介质释放[52]。栀子苷的产物京尼平,可通过下调解偶联蛋白-2表达,抑制游离脂肪酸诱导的肝细胞焦亡[53]。用中药复方降脂理肝汤干预高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠模型,结果显示与细胞焦亡发生相关的NLRP3、Caspase-1、脂多糖、Caspase-11表达水平均下降,推测其调控机制同时包括了经典通路和非经典通路[54]。

五、总结讨论

细胞焦亡这种较新型的细胞死亡方式,从被发现、被定义至今并时间不长,故迄今已开展的研究数量有限。在研究深度上,单纯细胞焦亡的发生机制较清晰,已明确数个关键靶点(如NLRP3炎症小体、AIM2、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD等)。MAFLD属于代谢性疾病,发病机制复杂,涉及多个脏器、多个病理环节,且不同的病程表现不同,还具有明显的个体差异性。细胞焦亡参与并促进MAFLD进展是明确的,不仅表现出直接促炎、促纤维化作用,还可对机体代谢环境产生负面影响而加速病程进展,另外或可通过加剧肝细胞脂肪变性途径。治疗方面,因NLRP3炎症小体对细胞焦亡的发生举足轻重,目前研究大都围绕其开展。NLRP3的激活亦受多因素影响,前文研究囊括了活性氧、AMPK、NRF2、P2X7R、CTCF/DPP4等介导通路,更多的上游信号通道等待被挖掘。此外,tRF-47、解偶联蛋白-2也可作为干预细胞焦亡的潜在靶点。

因肝脏与肠道在生理、病理上关系密切,肠道环境可影响肝脏细胞代谢。在Caspase-11依赖的非经典通路介导的细胞焦亡发生过程中,肠道来源LPS扮演重要角色。“从肠治肝”由来已久,而通过干预肠道菌群来抑制肝脏的细胞焦亡是新的内容之一,可进一步深入研究。此外,细胞焦亡过程释放的炎症介质(IL-1β、IL-18),对机体发生胰岛素抵抗有促进作用,正如MAFLD代谢性疾病的特点,治疗上除了着眼于发生在肝脏的细胞焦亡,还应考虑到肝外相关脏器。降糖药物(如利拉鲁肽、艾赛那肽)之所以被寄予厚望,也与它们治疗范围波及整体代谢环境有关。总之,细胞焦亡作为促进MAFLD进展的重要病理机制之一,有望成为干预MAFLD的重要切点。在遴选关键靶点、开发行效安全的抑制剂之前,研究者们仍前路漫漫。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。