鸡IL-15基因的克隆及序列分析

张 凤,田艳花,牛四坤,台晶杰,刘文娟

山西药科职业学院,山西 太原 030031

0 引言

细胞因子是由细胞分泌的一类具有调节细胞生长、分化和免疫活性的蛋白质。其是由免疫细胞(单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(血管内皮细胞、表皮细胞和成纤维细胞等)经刺激而合成并分泌的一类生物活性分子,它们介导免疫细胞之间的信息交换与相互调节,参与免疫应答和炎症反应过程[1]。自1957年发现干扰素以来,已有200余种细胞因子被发现。细胞因子种类很多,命名方法也不尽统一。白细胞介素(interleukin,IL)是由淋巴细胞、单核细胞以及其他细胞产生的细胞因子。

1994年,Grabstein et al.[2]从猿猴肾上皮细胞系成功分离出IL-15,并把其描述为一个具有类似IL-2生物活性的新的T细胞生长因子;Burton et al.以及Davies et al.[3-4]刺激人T淋巴细胞白血病病毒-1嵌着的白血病细胞系分泌出IL-T细胞因子,后来证实是IL-15。IL-15由单核细胞、巨噬细胞、骨髓间质、树突状细胞、角质化细胞及胸腺、肾、皮肤、 肠的上皮细胞产生。IL-15是IL-2细胞因子家族中的一员,具有很多类似IL-2的功能,但其结构与IL-2不相似,在先天和后天获得性免疫系统中有着重要作用,与骨髓移植、肿瘤、自身免疫性疾病、感染病等相关,并在其中扮演重要的角色[5],且在调控淋巴细胞的功能和稳态中起重要作用。IL-15可作为潜在的淋巴生长因子,给免疫恢复或免疫治疗的优化提供一个新的思路。

IL-15通过IL-15Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ链组成的IL-15R(IL-15Rα/IL-2Rβ/IL-2Rγ)发挥作用,因此具有与IL-2类似的生物学活性[5]。IL-15是NK细胞发育不可或缺的细胞因子之一,此外还能够激活成熟的NK细胞、T细胞、B细胞。

近年来随着分子生物学的蓬勃发展,白细胞介素也得到迅速发展。IL-15是一个多效性的细胞因子,在先天和后天获得性免疫系统中起着重要的作用,包括免疫性效应细胞(特别是NK、NKT和CD8+T细胞)的发育、激活、寻靶、生存及维持各自的特异性[6-7]。 IL-15在抗炎症、抗肿瘤、抗感染中起重要的作用[7]。因此,IL- 15在疾病的治疗及疫苗佐剂的开发方面具有很大的潜力。本研究基于基因工程技术扩增出ChIL- 15目的基因片段,为后续动物临床实验奠定基础。

1 材料

1.1 菌株和载体

DH5α感受态菌株为本实验室保存、pMD18-T(购于大连宝生物有限公司)。

1.2 主要试剂、仪器

RNAisoPlus、TaKaRa TaqTM 试剂盒、 PrimeScript® RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒、Bgl II 和 XhoI 限制性内切酶、DNA Marker DL2000、TIANgel Midi Purification Kit试剂盒、E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I试剂盒等均购于TIANGEN。电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技有限公司)、Mastercycler® personal(PCR仪) (美国Bio-rad公司)、DYY-Ⅲ型稳压电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、 DYY-Ⅲ型电泳槽(北京六一生物科技有限公司)、超净工作台(哈东联公司)、高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)、恒温水浴锅(北京长风仪器仪表有限公司)、恒温培养箱(北京长风仪器仪表有限公司)、漩涡混合器(北京长风仪器仪表有限公司) 、-20 ℃冷冻冰柜(海尔)、-80 ℃冷冻冰柜(海尔)、4 ℃冷藏冰箱(海尔)。

1.3 实验动物

山西省忻州种鸡场海兰褐1日龄雏公鸡,10只,体重(33±0.1)g。

2 方法

2.1 总RNA的提取

取鸡的脾脏,剪成小块并立即投入到液氮罐中。取冷冻组织60 mg,样品按照RNA iso Plus说明书提取操作。取RNA3 μL进行凝胶电泳,检测RNA的纯度;取RNA 2 μL反转录测RNA的完整性;取RNA 2 μL进行核酸测定仪检测其浓度,测定260 nm和280 nm;剩余的RNA保存于液氮罐中备用。

2.2 总RNA的电泳检测

取RNA 2.5μL与 1μL的上样缓冲液混匀,进行电泳,停止电泳后在凝胶成像系统中照相。

2.3 引物设计

根据美国国家生物信息中心(NCBI)数据库GenBank上已发表的鸡IL-15基因全序列,利用Prime 5.0软件设计一对引物,并在其5′端分别引入 Bgl Ⅱ,Xho Ⅰ酶切位点,引物序列为：

p1：GAAGATCTTAACAAGATGCTGGGGATGG(Bgl Ⅱ)

p2：GCCTCGAGTTGCGTATTTTAGTTAGCGT(Xho Ⅰ)

该引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

2.4 鸡IL-15基因的PCR扩增

2.4.1 反转录

按照反转录试剂盒说明书步骤操作进行cDNA第一链的合成。

2.4.2 PCR扩增鸡IL-15基因

PCR反应在200 μL的PCR管中进行,反应总体系为20 μL,包括上游特异性引物和下游特异性引物各1 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,模板 DNA 1 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加灭菌去离子水补足至20 μL,将反应液震荡混匀,瞬时离心后置PCR仪上进行扩增。

2.4.3 PCR产物电泳检测

取PCR扩增产物3 μL与1 μL的缓冲液混匀,进行凝胶电泳,在凝胶成像系统中照相。

2.5 PCR产物的纯化回收

按照PCR产物纯化试剂盒说明书操作。

2.6 鸡IL-15基因与pMD18-T 连接

按照试剂盒说明书操作。

2.7 pMD18-T-ChIL-15的转化

将转化后的pMD18-T-ChIL-15菌落进行鉴定。

2.8 pMD18-T-ChIL-15菌落的PCR鉴定

直接挑取LB平板培养基上的白色菌落作为模板进行菌落PCR鉴定。PCR反应在200 μL的PCR管中进行,反应总体系为20 μL,包括上游特异性引物和下游特异性引物各1 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加灭菌去离子水补足至20 μL。

PCR产物进行凝胶电泳检测,确定阳性克隆菌落。将阳性单克隆菌落用接菌环接取到LB液体培养基中,置于37 ℃,200 rpm恒温摇床培养8 h以上或过夜,取菌液送经北京华大基因公司进行序列测定。

2.9 pMD18-T-ChIL-15质粒DNA的提取

步骤按新质粒提取omega EZNA plasmid mini kit I试剂盒说明书进行提取操作 pMD18-T-ChIL- 15。

2.10 pMD18-T-ChIL-15质粒的鉴定

2.10.1 pMD18-T-ChIL-15质粒PCR鉴定

PCR反应在200 μL的PCR管中进行,反应总体系为20 μL,包括上游引物和下游引物各1.5 μL,10×Taq Buffer 2 μL,dNTP 2 μL,模板(pMD18-T-ChIL- 15质粒)1.5 μL,Taq DNA polymerase 0.3 μL,加灭菌去离子水补足至20 μL。

2.10.2 pMD18-T-ChIL-15质粒双酶切鉴定

双酶切体系为20 μL,包括pMD18-T-ChIL- 15 10 μL,Bgl II 1 μL,Xho I 1 μL,10×H Buffer 2 μL,加灭菌去离子水补至20 μL。

2.10.3 pMD18-T-ChIL-15的序列测定

将阳性克隆菌液送北京华大基因公司测序,阳性菌液命名为 pMD18-T-ChIL- 15。

3 结果

3.1 总RNA的提取结果

取总RNA 2.5 μL进行琼脂糖凝胶电泳,结果分别是28 s、18 s和5 s的3条带(见图1),检测总RNA的浓度及纯度合格。

图1-4：鸡脾脏总RNA样品

3.2 PCR结果

以cDNA为模版进行PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳结果约为580 bp,如图2所示。

1-2：ChIL- 15 的 PCR 产物;3：DNA Marker

3.3 pMD18-T-ChIL-15菌落的PCR鉴定

以pMD18-T-ChIL-15菌落为模版,进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳,结果是3、4泳道与预期大小不符,弃3、4泳道菌落,使用1、2泳道的菌落进行大量培养。

3.4 pMD18-T-ChIL- 15质粒鉴定

3.4.1 pMD18-T-ChIL-15质粒PCR鉴定

以质粒为模版进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳结果约为580 bp,见图3。

1-2：质粒 PCR 产物;3：DNA Marker

3.4.2 pMD18-T-ChIL-15的序列测定结果

将阳性克隆菌液送北京华大基因公司进行重组质粒双链DNA的双向测序,测序后结果表明扩增出ChIL-15的基因全长为581bp。

利用DNAMAN软件进行比对分析,经序列同源性结果表明：同源性为99.82% ,CDS区内第150个核苷酸发生变异,T变为C(T-C)。

利用 MEGA4.0 软件进行比对分析,经氨基酸同源性结果表明：同源性为100%。

4 结论

本试验成功从鸡的脾脏中扩增出ChIL-15,提取的质粒经PCR鉴定、酶切鉴定、测序结果比对及编码成氨基酸比对均与美国国家生物信息中心(NCBI)数据库GenBank中登录号AF139097.1基本相符合,编码区核苷酸的同源性为99.82%,其中CDS区内150位核苷酸发生变异,由T变为C。进行氨基酸的同源性比对,同源性为100% ,由于密码子的简并性,即使密码子的第三位碱基改变但是不会影响氨基酸翻译,所以氨基酸的同源性为100%,原因是ACC、ACT都可以编码为Thr。