铁碳强化潮汐流-潜流复合人工湿地处理模拟养殖尾水的启动运行效果

张 美，王家宏，白 杨

陕西科技大学环境科学与工程学院，陕西 西安 710021

近几年来，养殖业中使用的抗生素类药物和饲料的比重越来越高[1-2].抗生素不能被动物完全吸收，会随着动物的粪便排出体外，造成一定的环境污染问题[3]，还会增加细菌耐药性和抗生素耐药性基因的能力[4]，加大混合废水的处理难度[5]，进一步对人类生存环境以及身体健康带来危害[6-7].其中，四环素是养殖业中使用最普遍的一种抗生素，其废水的排放对环境造成了严重影响.Hong 等[8]对中国西北河西走廊108 个畜牧饲养厂36 种不同环境介质的有关抗生素成分进行检测评估，发现四环素大类中金霉素含量最高，达105 ng/g；陈小桐等[9]通过对辽宁省家畜禽养殖业中抗生素的排放进行分析，发现磺胺类和四环素类抗生素年排放总量达280 t；Wang 等[10]对东南地区畜牧养殖兽用抗生素进行风险评估，结果表明需重点关注四环素、土霉素等抗生素对环境造成的生态风险；吴永明等[11]在对江西某养猪场抗生素的研究中发现，四环素类抗生素在猪饲料和粪污中含量最高.当这些养殖尾水释放到环境中，会导致水生生物难以生存繁殖.国家正在大力发展养殖业，因此，开发一种经济、环保、高效的养殖尾水处理技术具有重要作用.

人工湿地是通过模拟天然湿地系统由人工搭建和管理的一种可持续发展的生态技术[12]，它具有高效、经济、去污效率高且管理方便等特点[13].卿叶[14]在研究养殖尾水中抗生素对人工湿地反硝化作用机理研究中表明，当四环素浓度≥100 μg/L 时可以降低水环境中各种形态氮的转化速率，尤其当浓度为2 mg/L时可彻底抑制水体中氮的转化过程.Chen 等[15]研究表明，0.2 mg/L 的四环素几乎不会对脱氮除磷效果造成不利影响，但在一定程度上抑制了反硝化的进行，阻碍了氮的去除.由于人工湿地类型及填料的选择和布料方式的不同[16]，其氮磷的去除效果也不尽相同[17]，因此近年来复合型人工湿地系统已经逐渐发展起来，并被广泛推广应用[18-20].污水在潜流式人工湿地系统中能与植物根系充分接触[21]，又能利用填料表面的微生物进行降解去除.潮汐流人工湿地是一种好氧-厌氧循环的生态系统，不仅能增加系统的富氧量，还可以增加污染物的去除效率.如Austin 等[22]在研究过程中发现，在处理同样体积的污水时，潮汐流人工湿地比曝气人工湿地对污染物的处理效果更好，同时消耗的能量更少，且占地面积也减半；Khajah 等[23]在潮汐流人工湿地脱氮性能研究中发现，该人工湿地系统可以最大限度地减少外部碳源的输入；Zheng 等[24]研究表明，潮汐流人工湿地能明显改善水体中的富氧情况，并使水体中污染物的去除效率得到明显的提升.铁碳填料具有高效、成本低、操作简单且可以强化系统的脱氮除磷功能等特点[25-26]，被广泛应用于强化工艺系统的脱氮除磷.如Liao 等[27]的研究表明，Fe-C基质和松树皮可以作为增强垂直上升流人工湿地对再生水中氮和磷的替代基质，Fe-C 基质的加入显著改变了微生物群落，增强了反硝化作用；Wei 等[28]在人工湿地系统中利用铁碳微电解提高了净化污染物和去除重金属的能力，结果显示，TN 的去除率为89.04%，铬的去除率为98.96%，铅的去除率为97.09%；Dai 等[29]利用铁碳填料构建了湿地微生物燃料电池处理废水中环丙沙星污染物，发现该系统对于磷酸盐和环丙沙星的去除效率有明显的提高.

因此，本研究采用实验室自制的铝基陶粒(PCW)填料构建潮汐流-潜流复合人工湿地系统，并在二级潜流系统中添加适量的铁碳填料与自制陶粒(CCW)结合，以此来实现铁碳微电解工艺与潜流式人工湿地系统的联用.在此条件下，探究四环素和铁碳填料在启动期对湿地系统内各污染物去除情况的影响以及微生物群落结构和物质组成的变化，以期为人工湿地处理含抗生素废水的研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 潮汐流-潜流复合人工湿地的构建

如图1 所示，在实验室内搭建两组模拟潮汐流-潜流组合人工湿地系统(高1 130 mm，内径130 mm，外径160 mm)，设置四环素实验组(TC 组)和对照组两组系统，其进水水质略有不同(详见1.2 节).一级系统和二级PCW 系统装置从上到下分别填充粒径为6～9 mm、3～6 mm、9～12 mm 的实验室自制陶粒[30]，二级CCW 系统的2 号和3 号取样点间分别填充两层高12 cm 的新型铁碳微电解填料(购自平顶山市绿之原活性炭有限公司)，其余与一级系统和二级PCW 系统填充方式相同.每个系统装置底部均铺设直径为2～3 cm 的鹅卵石作为支撑层，沿程设置4 个取样点.

图1 潮汐流-潜流复合人工湿地系统装置Fig.1 The tidal flow-subsurface flow composite constructed wetland test equipment

1.2 试验设计和进水水质

本研究所使用的接种污泥是从某污水处理厂二沉池中提取，将稀释后的活性污泥加入各装置中进行挂膜和启动，进行3 d 微生物培养，每天更换营养液.一级系统采用的是间歇进水/瞬时排水的潮汐流模式，淹没时间为12 h，空置时间为12 h；二级系统采用的是间歇进水模式，淹没时间为24 h.实验启动时间为春季，启动期间室温温度为18～22 ℃.

进水依据畜禽养殖尾水水质在实验室进行人工配制，水中碳源、氮源和磷源分别由CH3COONa、NH4Cl 和KH2PO4模拟配置而成，COD、NH4+-N 和TP的浓度分别为300、60 和5 mg/L.TC 组加入0.2 mg/L的盐酸四环素溶液.

1.3 常规水质分析方法

每天采用棕色玻璃瓶在同一时间、同一取样口进行取样，水样于4 ℃冰箱中低温储存.水质指标的分析方法[31]如下：TP 浓度采用钼酸铵分光光度法测定；CODCr浓度采用快速消解分光光度法测定；NH4+-N浓度采用纳式试剂分光光度法测定；NO3--N 和NO2--N浓度采用紫外分光光度法测定；TN 浓度采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定.

1.4 微生物测定方法

选用脂磷法作为湿地生物量的测定方法，具体参照于鑫等[32]的操作步骤.应用高通量测序技术研究两组湿地系统不同处理单元在启动期时脱氮除磷微生物群落结构和物种组成的变化情况.

2 结果与讨论

2.1 启动期各污染物去除效果

2.1.1 CODCr的去除效果

CODCr进出水浓度和去除率如图2 所示.由图2可见，启动前期CODCr的出水浓度有较大的波动，随着时间的推移系统逐渐稳定，CODCr的去除率逐渐增加且相对稳定.人工湿地系统中，CODCr的去除主要是通过微生物的吸收利用、填料的吸附过滤和植物根系的截留作用，TC 组和对照组中一级系统启动后期CODCr去除率范围为72.58%～84.59%，二级CCW系统和二级PCW 系统在启动期去除率范围最终均为91.41%～92.84%.

图2 湿地系统启动期CODCr 的去除效果Fig.2 The removal effect of CODCr in the start-up period of wetland system

从图2 还可以看出，四环素的存在降低了一级系统对CODCr的去除率，二级系统中CODCr的去除没有发生明显的变化.废水中CODCr大部分在一级系统中得到去除，一级系统潮汐流方式具有较强的富氧能力，可以为系统中微生物提供更多的氧，从而促进有机物的去除，并且一级系统采用的自制陶粒表面粗糙、内部孔隙发达，利于微生物的生长，进一步促进CODCr的去除.因此，四环素的加入在一级系统中存在明显抑制作用，废水进入二级系统中CODCr浓度较低，抑制作用较低.

TC 组和对照组在二级CCW 系统中的CODCr平均出水浓度(分别为36.32、39.84 mg/L)都比二级PCW系统(分别为55.09、52.14 mg/L)低.添加铁碳填料在人工湿地中进行原电池反应，将大分子有机物降解为微分子有机物[33]，促进微生物的生物降解，改善废水的生化性，强化CODCr的去除效果.

2.1.2 TP 的去除效果

从图3 可以看出，随着时间的推移，启动期TP 的进出水浓度以及去除率均保持着相对稳定的状态.一级、二级系统去除率均较高，其中一级去除率为87.14%～88.64%，二级去除率为93.57%～96.04%.人工湿地中TP 主要通过填料对磷的吸附[34]、植物根茎的吸收和聚磷菌吸磷等方式去除[35]，因启动期生物膜还处于不断生长的状态，故磷的去除主要靠填料的吸附截留.

图3 湿地系统启动期TP 的去除效果Fig.3 The removal effect of TP during the start-up period of wetland system

相比于对照组，TC 组一级系统和二级系统TP去除率分别降低1.5%、2.7%.这表明四环素的加入具有一定的刺激性，使填料吸收磷的能力降低，从而降低磷的去除效率[36].二级CCW 系统的处理效果优于二级PCW 系统，较二级PCW 系统的处理效果提高了0.73%～2.47%，可能是由于人工湿地系统中添加了铁碳填料，其对磷发挥协同效应，PO43-易与铁碳填料中的Fe3+、Fe2+生成磷酸盐沉淀从而将磷去除[25].此外，水解铁产生的含水Fe3+和Fe2+还可以吸附磷酸盐形成含水氧化铁-磷酸铁络合物[25].因此，添加铁碳填料可以强化人工湿地系统对磷的去除.

2.1.3 氮的去除效果

经系统处理后NH4+-N 和TN(见图4)的出水浓度显著降低，一级系统可以去除大部分的NH4+-N 和TN，NH4+-N 经二级系统净化后基本可以完全去除，两级系统对NH4+-N 和TN 的去除率分别为98%和88%.

图4 湿地系统启动期NH4+-N 和TN 的去除效果Fig.4 The removal efficiency of NH4+-N and TN during the start-up period of wetland system

对比TC 组和对照组发现，四环素对NH4+-N 的去除有明显的抑制作用，一级系统NH4+-N 去除率平均下降9.57%.与二级CCW 系统相比，二级PCW 系统NH4+-N 及TN 的去除更易受四环素的影响.但四环素对系统中NO3--N 和NO2--N 的积累影响不大，其在体系中的残留浓度可以作为去除NO3--N 和NO2--N 的补充碳源.同时发现，二级CCW 系统对NH4+-N 的处理效果以及启动后期对TN 的处理效果均优于二级PCW 系统，其中TN 的影响更为明显，TC 组和对照组中二级CCW 系统TN 去除率比二级PCW 系统分别高出5.77%和3.84%，这与赵仲婧等[37]研究结果一致.这是由于Fe 的加入增加了氨单加氧酶和亚硝酸盐氧化还原酶的量[38]，这两种酶的存在有利于NH4+-N 的硝化[39].另外碳的存在可以提高对NH4+-N 的吸附能力，也可以为微生物提供营养物质，提高微生物的丰富度[40]，有利于NH4+-N 的去除.铁碳微电解的形成可以为系统提供[H]和Fe2+供反硝化过程利用[41]，从而提高TN 的去除率.与二级PCW 系统相比，二级CCW 系统中NO3--N 和NO2--N 的积累量(见图5)较低，说明铁碳系统可以利用微小原电池电极的腐蚀为其提供大量的电子.铁碳填料在转换反应中会产生Fe2+和Fe3+，这两种物质易与四环素发生络合，生成活性氧自由基(ROS)，ROS 和四环素及其氧化物结合形成的复合物能够与四环素分子发生反应生成各种氧化产物，从而加快四环素的降解[42-43].因此，在四环素浓度较低的情况下，铁碳填料的添加也可能对四环素的去除起到了积极的作用，CCW 系统中四环素对NH4+-N 及TN 的去除抑制作用不大.

图5 湿地系统启动期NOx--N 的积累Fig.5 The accumulation of NOx--N during the start-up period of wetland system

2.2 启动期生物量分布

判断微生物的生长情况最直接最有效的方法是生物量的测量.图6 为启动完成后两组系统6 个反应器沿程的微生物分布情况.由于中层为小粒径填料，堆积密度较高，可以承载更多的微生物，一级系统中TC 组和对照组生物量均表现为中层˃下层˃上层.二级CCW 系统中TC 组生物量表现为中层˃上层˃下层，二级PCW 系统中TC 组生物量表现为上层˃中层˃下层；而二级CCW 系统和二级PCW 系统中对照组生物量均为上层最大.TC 组和对照组沿程生物量的差异可能是由于受到四环素的影响，并且生物量大小与基质的比表面积和堆积密度有关，因此不同系统不同填料深度的生物量大小不同.

图6 湿地启动期不同单元沿程生物量分布Fig.6 The biomass distribution of different units along the wetland start-up period

通过两组系统的对比，四环素的加入会影响生物量的大小，部分区域生物量有所增加，可能是四环素的存在使部分微生物代谢缓慢，对四环素具有抗药性的微生物大量繁殖，因此，加入四环素在某种程度上会促进生物量的增加.由图6 可见，二级PCW 系统中生物量高于二级CCW 系统，但根据对污染物去除情况的分析可知，生物量越高并不一定就意味着对污染物的去除率就越高.

2.3 启动期微生物扫描电子显微镜(SEM)分析

图7 为启动运行前填料及运行一个月后填料(均取自2 号取样口且生物膜附着较明显的陶粒颗粒)的表面SEM 图.从图7(a)可以看出，原材料表面粗糙，这种结构有利于微生物的附着.当生物膜形成之后，可以看出填料表面较为光滑，明显被大量微生物菌群附着，实际中对比填料发现其表面生物膜由淡黄色变成棕褐色.这湿地系统内生物系统已经稳定，形成了微生物群落.TC 组表面的微生物膜比对照组覆盖的微生物菌群多，且更为光滑，表明少量四环素作为补充碳源被微生物吸收利用，可以促进系统中某些耐药菌的增长.由于是运行初期，四环素未产生抑制作用，但由于四环素一直作用于生物膜上，会使生物膜细菌变得敏感脆弱，对后期运行中污染物的去除产生影响.二级CCW 系统表面生物膜较二级PCW 系统附着更明显，说明加入铁碳填料为微生物提供了更多的营养物质，对微生物生长提供了有利条件.

图7 湿地启动期生物膜SEM 图Fig.7 SEM of biofilm in wetland startup period

2.4 启动期微生物群落分析

2.4.1 Alpha 多样性分析

2.4.1.1 Alpha 多样性指数

为了探究加入少量四环素对微生物群落机制的影响，对各系统菌群群落进行了研究.基于Chao1 指数和Observed_species 指数(见图8)可以看出：TC 组中菌群丰富度最高的是二级CCW 系统，且上层最高；对照组中菌群丰富度最低的是二级CCW 系统，最高的是一级系统.一级系统的进水为微生物提供了大量的营养物质，使其可以加快繁殖生长，增加微生物的丰富度.由于四环素的加入，TC 组二级CCW 系统与二级PCW 系统中抗生素可能被作为补充碳源供微生物利用，二级CCW 系统中四环素与铁碳协同具有促进微生物生长的作用，因此TC 组中二级CCW 系统上层菌群丰富度最高.从Shannon-Wiener 指数、Simpson 指数及Palou′s evenness 指数可知，TC 组中二级PCW 系统上层菌群多样性最高，其次是一级系统，且一级系统优势种群最明显，这是由于大量营养物质存在于一级系统，加之潮汐流的运行方式可以为微生物提供氧及营养物质的交替，促进物种丰富度增高[30].TC 组中二级CCW 系统微生物群落多样性高于二级PCW 系统，进而验证铁碳可以促进微生物生长，强化复合人工湿地的脱氮除磷.

图8 Alpha 多样性指数箱状图Fig.8 Alpha diversity index box chart

2.4.1.2 稀疏曲线

图9 为启动期微生物测序的稀疏曲线.由图9 可见，随着测序深度的不断增加，曲线还未呈现平缓趋势，说明目前在启动期多样性尚未接近饱和.启动期结束后，对照组一级系统的微生物多样性最大，二级CCW 系统的微生物多样性最低，这与Alpha 多样性指数的分析结果相同.

图9 样本稀疏曲线图Fig.9 Sample sparse curve graph

2.4.2 微生物群落物种相对丰富度变化

用高通量测序技术研究TC 组和对照组物种的水平分布，探究物种种类及数量的变化情况.从图10(a)可以看出，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)和绿湾菌门(Chloroflexi)均为人工湿地常见的菌门.TC 组和对照组的3 个不同系统不同沿程的优势门都为Proteobacteria，占所有检测到微生物的40.6%～71.04%.它包含很多脱硝除磷的细菌，TC 组和对照组中一级系统的Proteobacteria 均大于二级系统，一级系统上层变形菌相对丰度大于中层和下层，与一级系统去除废水中大量污染物的研究结果相对应.Proteobacteria丰富度在TC 组一级系统和二级PCW 系统中均大于对照组，由于变形菌对抗生素具有高度耐受性，同时少量抗生素可作为营养物质供变形菌生长，所以该门丰富度的增加与少量四环素的加入有关[44].Hedrich等[45]研究表明，Proteobacteria 中存在铁氧化细菌，进而促进氮磷的去除.Bacteroidetes 具有降解大分子物质的能力，可以通过许多酶催化反应促进抗生素等有机物的降解[46].在二级CCW 系统和二级PCW 系统中，加入少量四环素后Bacteroidetes 丰富度略增加，二级PCW 系统中层增加较为明显，而一级系统上层则丰富度降低，可能是由于一级上层系统在加入少量四环素后更适合变形菌门(Proteobacteria)的生长.与二级PCW 系统相比，二级CCW 系统中的铁碳填料能够将大分子物质转变为小分子物质，促进Proteobacteria和Bacteroidetes的生长，从而促进NH4+-N 的去除.Firmicutes 具有极端条件耐受性和低生物利用度[47]，因此加入四环素后系统中Firmicutes 丰富度并未降低.Proteobacteria、Firmicutes 与Chloroflexi 都可以对氮的降解起到积极作用.

图10 TC 组和对照组细菌群落结构的分布Fig.10 The distribution of bacterial community structure in TC group and control group

TC 组和对照组中存在的微生物在纲水平的主要物种组成情况如图10(b)所示，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和 γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)都属于Proteobacteria.通过不同系统不同沿程的对比，Gammaproteobacteria 的相对丰度最高，占33.30%～55.34%，其中对照组二级CCW系统中层最高.Gammaproteobacteria 在人工湿地中可参与CODCr的降解，一定程度上也促进了氮的去除.在加入少量四环素后，较利于Alphaproteobacteria 的生长，它在硝化进程中具有重要作用，与对照组相比，一级系统上层拟杆菌纲(Bacteroidia)和弯曲杆菌纲(Bacteroidoa)的丰富度降低较为明显.除此之外，与对照组相比，TC 组出现了硝化螺旋菌纲(Nitrospira)，其含有许多可以降解抗生素的酶，对四环素的降解有重要意义.

TC 组和对照组属水平上微生物的组成如图10(c)所示，马里诺杆菌属(Marinobacter)为系统中的优势属，其中，对照组中二级CCW 系统中层其相对丰度最高，TC 组一级系统和二级CCW 系统菌群丰富度较低，说明添加铁碳会促进马里诺杆菌属(Marinobacter)的生长繁殖，这是由于Marinobacte利用氧和硝酸盐作为末端电子受体，铁作为电子供体[48]，使其菌属本身更有利于在系统中生存，而四环素的加入可在某种程度上抑制该菌的生长和繁殖.硫螺菌属(Sulfurospirillum)是一类厌氧菌属，四环素的加入对一级上层中Sulfurospirillum产生了明显的抑制作用，而二级CCW 系统对其丰富度产生了促进作用，即铁碳填料为Sulfurospirillum提供了有利的生存条件.Sulfurospirillum的存在可以促进NO3-和NO2-的去除[49]，因此二级CCW 系统对NO3-和NO2-的积累量少于二级PCW 系统，促使系统TN 浓度降低.食烷菌属(Alcanivorax)是一类有机污染物降解菌属，有利于降解四环素，也可以利用四环素作为碳源和能源物质生长.在兼性厌氧的条件下，食烷菌属(Alcanivorax)通过硝酸盐为电子供体获得能量进行生长繁殖.索氏菌属(Thauera)和副球菌属(Paracoccus)是TC 组特有的两种优势属，都是革兰氏阴性菌，具有反硝化能力.当NO3-、NO2-或NO 存在时，其作为电子受体供菌属厌氧生长，对湿地系统中累积的硝酸盐的去除发挥了重要作用.其中二级CCW 系统中Thauera的物种丰富度要高于二级PCW 系统，因此也再次解释了二级CCW 系统中硝酸盐积累量低的原因.“Others”在微生物属水平占比较高，尤其在TC 组一级系统上层，它是系统中未经鉴定的新物种，可能对系统产生重要影响.

3 结论

a) 两组潮汐流-潜流复合人工湿地系统中污染物的去除均以一级系统处理为主.加入0.2 mg/L 的四环素对常规污染物的去除存在一定的抑制作用，使各种污染物的平均去除率降低0.59%～9.57%；二级CCW 系统比二级PCW 系统具有更好的去除效果，铁碳填料的加入在不同方面促进不同污染物的去除，使各污染物平均去除率提高了0.46%～5.81%.CODCr、TP、NH4+-N 和TN 出水浓 度分别 在21.85～24.54、0.12～0.20、0.18～0.71 和7.16～9.28 mg/L 之间.

b) 启动期加入0.2 mg/L 的四环素对人工湿地系统生物量的增加没有产生抑制作用.对照组中，二级CCW 系统生物量低于二级PCW 系统，铁碳的加入并未对生物量的增加提供有利条件；TC 组中，通过启动前后SEM 图分析，少量四环素的加入对填料表面生物膜产生的作用较小，而铁碳填料的加入使TC 组二级CCW 系统中填料表面的生物膜量高于TC 组二级PCW 系统.

c) Proteobacteria 促进系统反硝化进程且对抗生素具有高耐受性，对氮磷的去除也具有重要作用.Bacteroidetes 的存在利于抗生素等有机大分子分解.与二级PCW 系统相比，铁碳填料为Proteobacteria 和Bacteroidetes 提供了有利的生长条件，从而促进二级CCW 系统中NH4+-N 的去除.四环素的存在对Marinobacter具有抑制作用，而铁碳填料对其具有促进作用.因此，四环素和铁碳填料的长期作用下会改变系统微生物群落中菌群的丰富度和多样性.