基于毒理基因组学的工业废气颗粒物毒性分析方法及应用

何 剑，吴兴刚，王珊珊，郑 兴，刘玉玲

西安理工大学市政与环境工程系，陕西 西安 710048

目前，颗粒物的毒理研究主要采用细胞体外暴露和动物暴露实验的方法[1].在细胞体外暴露实验中，颗粒物会与细胞直接接触并引起细胞毒性反应，通过分析细胞毒性的变化和差异，可以评估颗粒物的毒性和毒理机制[2-4].华秋翰等[5-6]采用人支气管上皮细胞进行颗粒物染毒，对细胞的氧化损伤效应、细胞凋亡和DNA 损伤数据进行相关性分析.Saint-Georges等[7]将支气管中分离出的人肺泡巨噬细胞暴露于敦克尔市的PM2.5中，旨在提高对大气颗粒物诱导细胞毒性的作用机制的认识.然而，细胞体外暴露实验涉及到昂贵的培养基、试剂以及细胞培养器具的采购和维护，增加了实验的经济成本，由于细胞培养和处理的复杂性，这种方法需要较长的周期来进行实验操作和结果分析，限制了实验的效率和及时性[8].动物暴露实验则更直接模拟了人体暴露于环境污染颗粒物的情况，观察其对动物的影响，评估颗粒物的毒性和毒理机制，从而更好地指导环境保护和健康预防工作[9].Ying 等[10]应用空气富集浓缩系统对实验小鼠染毒，研究大气颗粒物在浓缩环境的心血管毒性.Chen等[11]将小鼠暴露于高污染PM2.5环境中进行自主呼吸染毒实验，研究环境颗粒物对敲除载脂蛋白E 的小鼠动脉硬化的影响.然而，这种方法涉及到动物的饲养、繁殖和实验操作等方面的成本，以及实验操作所需的耗材和设备.此外，动物实验需要经过伦理审查，增加了实验的复杂性和周期[12].

近年来，随着分子生物学、基因组学等技术的发展，基于毒理基因组学的方法也开始尝试应用于颗粒物毒理研究中，通过对基因表达等方面的分析，进一步揭示颗粒物的毒理机制和作用途径[13-17].但毒理基因组学法如微阵列、蛋白组学、代谢组学等[18-19]仍具有消耗资源、操作复杂以及成本较高的缺点，缺乏标准的结果解释方法与即时性.为了解决这些问题，Gou 等[20]开发了一种利用GFP (Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)重组大肠杆菌的细胞阵列毒性评估方法，提出使用TELI 值(Transcriptional Effect Level Index，转录效应水平指数)来量化化学物质诱导的基因表达水平变化，并通过TELI 剂量-反应曲线推导出相关的毒性终点，可同时检测多种应激反应途径，具有快速、准确、灵敏等优点[21].由于该方法涉及到多个学科领域，对于实验设计、样本选择、数据分析等都需要制定相应的标准化流程，且缺乏合适的预处理方法，导致颗粒物的整体毒理分析受到限制[22].

为了能准确高效地测定工业废气颗粒物的毒性，本研究采用毒理基因组学的毒性测试方法，通过大量探索性实验，提出了新的预处理手段来解决该方法在工业废气颗粒物测试中的应用障碍，分析验证该方法对工业废气颗粒物毒性检测的可行性，并应用于钢铁厂烧结机头电除尘器内颗粒物的毒性分析，得到了废气颗粒物毒性变化规律和毒性大小，提出了毒理基因组学方法应用在工业废气颗粒物毒性分析的工作流程，以期为工业废气颗粒物的深度治理和毒性检测提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

实验涉及的六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)、无水氯化钙(CaCl2)、硫酸卡那霉素(C18H38N4O15S)和M9低盐培养基(Gibco™ M9)分别购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心、天津市申泰化学试剂有限公司、北京诺博莱德科技有限公司和上海瑞楚生物科技有限公司，LB 肉汤(Lennox)、葡萄糖(C6H12O6)、硝酸(HNO3)、过氧化氢(30%H2O2)、丙醇(C3H8O)、甲醇(CH3OH)均购自国药集团化学试剂有限公司.主要仪器涉及电热恒温培养箱(WP25AB 型，天津泰斯特仪器有限公司)、全自动移液工作站(epMotion 5075 t 型，艾本德股份公司，德国)、立式压力灭菌锅(LDZX50KBS 型，上海申安医疗器械厂)、酶标仪(Cytation5 型，广东省化学试剂工程技术研究开发中心)、紫外灯箱(LX-2130 型，西安曼哲机械设备有限公司)、超声清洗仪(Jipad22-500 型，上海旌派仪器有限公司).

1.2 实验菌株

实验菌株为GFP 转染的包含有110 种不同启动子的大肠杆菌，这些启动子控制大肠杆菌K12、MG1655 中最常见的应激反应和其他特定生理功能相关的基因表达.每个启动子融合都由低拷贝质粒pUA66 或pUA139 表达，该质粒包含一个卡那霉素抗性基因和一个快速折叠的gfpmut2基因，能够以高精度和可重复性测量基因表达[23]，所有应激基因的相关功能可在www.ecocyc.com 查询.

1.3 工业废气颗粒物的采集及预处理

1.3.1 工业废气颗粒物的采集

根据钢铁厂废气颗粒物的排放特点，采集焦化工序的焦炉尾气及烟尘，样品来自宝山钢铁股份有限公司；钢铁厂烧结机头电除尘器内不同电场颗粒物样品采自新疆昆玉钢厂.

1.3.2 工业废气颗粒物有机组分提取

取10 mg 的工业废气颗粒物样品，加入装有10 mL 甲醇与丙醇体积比为1∶1 的离心管中，超声振荡30 min[24]，氮吹至近干，加入10 mL 超纯水，并超声30 min，0.45 µm 微孔的滤膜过滤，得到工业废气颗粒物有机组分染毒液，把滤液装入15 mL 无菌尖底离心管中保存.以此为原样，将原样用超纯水以10倍等梯度稀释为6 个梯度浓度.

1.3.3 工业废气颗粒物无机组分提取

取10 mg 工业废气颗粒物样品研磨至粒径在10 μm 及以下，将研磨后的颗粒物样品加入装有10 mL 超纯水的烧杯中混合均匀，超声振荡30 min，通过0.45 μm 滤膜过滤后将滤液置于常温储存；将滤渣放入烘箱烘干，二次研磨，并将研磨后的颗粒物加入装有5 mL 30%HNO3溶液的烧杯中，超声振荡30 min，加入5 mL 的30%H2O2溶液，超声振荡1 h；95 ℃高温振荡至无明显液体时，加入10 mL 上述储存滤液，振荡1 h，再通过0.45 μm 滤膜过滤，得到颗粒物无机组分染毒液.

1.4 工业废气颗粒物毒性测试方法

毒性测试过程中，受试生物对于样品暴露下的耐受浓度是有一定限制的，需要满足受试生物的细胞存活率高于95%才可以进行测试[21].工业废气颗粒物预处理后，将初始浓度为10 mg/mL 的样品用超纯水以10 倍等梯度稀释为6 个梯度，分别稀释至1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 mg/mL；之后进行细胞存活率(最大耐受浓度)实验，得到大肠杆菌最大耐受浓度(EC5)，然后以EC5为实验浓度上限依次向下稀释10 倍进行实验.毒性测试仪器为酶标仪，具体实验过程：将大肠杆菌菌株置于96 孔板中，在37 ℃条件下静置过夜培养；将培养好的大肠杆菌使用的1×M9 培养基按1∶5 稀释，转接至384 孔板；将384 孔板中的菌液在37 ℃下培养5～6 h，使其光密度OD600达到早期指数生长阶段(约为0.2)；培养后的384 孔板中添加不同浓度的颗粒物溶液；为了测定颗粒物诱导的基因转录水平效应，将384 孔板置于微孔板成像仪中，同时测OD600和荧光读数GFP 水平(激发波长为45 nm，发射波长为528 nm)，以2 h 为暴露时间，每5 min 测定一次读数，实验设置3 组平行样.实验过程如图1 所示.

图1 实验流程示意Fig.1 Flow chart of toxicological genomics experiment

1.5 TELI 值计算

将颗粒物暴露导致的特定基因在每个时间点基因表达的改变称为诱导因子I.I=Pe/Pc，Pe 和Pc 分别表示基因在化学样品暴露条件和对照(无化学样品暴露)条件下的表达水平[25].若I˃1，表明对该基因起正向调控作用；若I<1，表明对该基因起负向调控作用.利用各时间点I的自然对数(lnI)进一步分析，确定并分析特定应激反应通路有关的遗传变异，从而揭示毒理机制.通过确定单个基因的TELI 值(TELIgene)，或代表特定途径(TELIpathway)、氧化应激(TELIoxidative)、DNA 应激(TELIDNA)、膜应激(TELImembrane)、蛋白应激(TELIprotein)和普遍应激(TELIgeneral)以及整体基因(TELItotal)的TELI 值，可以对颗粒物的毒性进行评价.特定基因在2 h 暴露时间内的累计转录效应的TELI计算公式：

式中：i为测定库中基因的数量；t为暴露时间，h.

在颗粒物暴露条件下，反应大肠杆菌细胞总体转录水平的TELI 值，即TELI(total)，计算公式：

式中，W为总应激反应中每类应激反应的权重因子，定义其值为1.此外，使用TELI 值量化物质诱导的基因表达水平变化值，当TELI≥1.5 时，应激反应转为毒性效应[23].

1.6 毒理分析方法

为了评估工业废气颗粒物诱导大肠杆菌细胞基因表达或应激反应的强弱，以TELIpathway数据为基础制作红黑热图.在钢铁厂不同焦化工序和不同颗粒物样品浓度条件下，通过颗粒物红黑热图的颜色确定应激反应类别.采用四参数非线性回归模型(4PL)拟合分析以TELItotal数据为基础的浓度-响应曲线，得到焦化工序废气颗粒物的受试浓度范围及毒性终点，并且通过工业废气颗粒物的毒性作用模式和作用机制的相似度使毒性物质的分类更加精确.

2 方法验证

2.1 实验细胞存活率测试

对某钢铁厂焦化工序(干熄焦、导焦、推焦)废气颗粒物进行预处理，然后进行细胞存活率实验.由图2可见，焦化工序废气颗粒物样品在高浓度时对细胞生长表现出抑制作用，通过稀释颗粒物样品大肠杆菌细胞存活率均可达95%，随着各样品溶液稀释倍数的增加，OD600值增高，大肠杆菌细胞活性增强.大肠杆菌细胞在干熄焦、导焦、推焦有机组分暴露的最大耐受浓度分别为10、0.01、0.1 mg/mL，无机组分暴露的最大耐受浓度分别为1、0.1、0.1 mg/mL.

图2 钢铁厂焦化工序废气颗粒物样品浓度对细胞生长的抑制情况Fig.2 Inhibition of cell growth by sample concentration of exhaust particulate matter in coking process of iron and steel plant

2.2 验证实验结果分析

以TELIpathway数据为基础作焦化工序废气颗粒物诱导大肠杆菌基因表达的红黑热图，结果如图3所示.由图3 可见，焦化工序废气颗粒物有机组分诱导大肠杆菌产生的共同应激模式为氧化应激.研究[26-27]表明，颗粒物中有机组分多环芳烃(PAH)在酶的作用下可转化为醌类，从而产生氧化应激效应，表现为细胞内氧化损伤的程度明显增加.此外，笔者研究发现，干熄焦和导焦颗粒物有机组分可诱导细胞产生较为明显的蛋白应激.推焦和导焦颗粒物无机组分诱导细胞的应激模式分别为DNA 应激和膜应激，与已有研究所得结论[28-29]吻合.产生DNA应激反应是因为金属元素芬顿(fenton)反应产生活性氧，刺激内质网应激效应，从而导致DNA 链发生断裂，而细胞发生膜应激是由于颗粒物表面氧化自由基过多，产生脂质过氧化氢反应，从而影响细胞膜结构改变.因此，将毒理基因组学毒性测试方法应用于工业废气颗粒物的毒性测试中，得到的应激反应模式与现有研究结论[30]一致.同时还发现，焦化工序废气颗粒物有机组分诱导细胞表现出潜在的蛋白应激模式，说明毒理基因组学的毒性测试方法不仅具有准确性，还能更加全面地阐述潜在的毒性模式.

图3 钢铁厂焦化工序废气颗粒物有机组分和无机组分的毒性作用模式Fig.3 Toxicity mode diagram of organic and inorganic components of particulate matter in coking process of iron and steel plant

3 基于毒理基因组学的工业废气颗粒物毒性分析方法应用

为研究钢铁厂烧结机头电除尘器内颗粒物毒性的变化规律，采集某钢铁厂烧结机头电除尘器1 号～4 号电场下灰斗卸灰样品，4 个电场按从前到后排列，前后电场中颗粒物的粒径和密度存在差异.按1.4 节方法进行大肠杆菌的存活率(最大耐受浓度)实验，结果如图4 所示.

图4 电除尘器内各电场颗粒物样品浓度对细胞生长的抑制情况Fig.4 The concentration of particulate matter samples in each electric field in the electrostatic precipitator inhibits cell growth

由图4 可见，在电除尘器4 个电场(1 号、2 号、3 号、4 号)中大肠杆菌对颗粒物有机组分暴露的最大耐受浓度分别为1、10、1 和0.1 mg/mL，对颗粒物无机组分暴露的最大耐受浓度分别为0.1、0.1、0.1和0.01 mg/mL.

3.1 基于毒理基因组学的毒性作用模式分析

通过钢铁厂烧结机头电除尘器内各电场颗粒物作用模式(见图5)发现，暴露于4 个电场的颗粒物有机组分后，大肠杆菌均表现出氧化应激反应，与已有研究结果[31]一致.其中，在1 号电场颗粒物的有机组分暴露中还表现出较为明显的普遍应激，而普遍应激的已知功能是细胞生物化学和物理稳态的干扰，推测是因电场颗粒物的有机组分对重组大肠杆菌的生物化学稳态造成干扰，进而导致普遍应激损伤.暴露于4 个电场的颗粒物无机组分后，大肠杆菌却表现出不同的毒性作用模式，1 号电场颗粒物引起的普遍应激反应最强烈，2 号电场颗粒物引起的DNA 应激较为明显，3 号电场颗粒物引起的氧化应激和蛋白应激模式较为明显，4 号电场颗粒物则诱导大肠杆菌表现出较为强烈的蛋白应激.通过毒性作用模式图能够快速揭示工业废气颗粒物的毒性作用途径.

图5 电除尘器各电场颗粒物毒性作用模式图Fig.5 Toxicity mode diagram of particles in each electric field of electrostatic precipitator

3.2 工业废气颗粒物毒性作用机制研究

将大肠杆菌暴露于电除尘器内各电场不同颗粒物浓度下有机组分和无机组分中，对5 大类应激反应的结果进行汇总分析，得到各类应激TELI 值(TELIoxidative、TELIprotein、TELImembrane、TELIgeneral、TELIDNA)，结果如图6 和图7 所示.

图6 电除尘器各电场不同颗粒物浓度下有机组分诱导细胞的应激反应变化情况Fig.6 The stress response histogram of cells induced by organic components of particulate matter in each electric field of electrostatic precipitator at different concentrations

图7 电除尘器内各电场不同颗粒物浓度下无机组分诱导细胞的应激反应变化情况Fig.7 The stress response histogram of the cells induced by the inorganic components of the electric field particles in the electrostatic precipitator at different concentrations

由图6 和图7 可见，钢铁厂烧结机头电除尘器内各电场颗粒物有机组分和无机组分诱导细胞产生了不同应激表达水平.对于电除尘器内颗粒物有机组分而言，1 号电场颗粒物有机组分主要诱导细胞产生的应激模式为膜应激、氧化应激和普遍应激；2 号电场颗粒物有机组分主要诱导细胞产生氧化应激和膜应激，特别在颗粒物有机组分浓度最高时，出现了强烈的普遍应激反应；3 号电场颗粒物有机组分主要诱导细胞产生蛋白应激和膜应激；4 号电场颗粒物有机组分主要诱导细胞产生氧化应激和DNA 应激.对于电除尘器内颗粒物无机组分，1 号电场颗粒物无机组分主要诱导细胞产生的应激模式为普遍应激和DNA应激；2 号电场颗粒物无机组分主要诱导细胞产生DNA 应激和普遍应激；3 号电场颗粒物无机组分主要诱导细胞产生氧化应激和蛋白应激；4 号电场颗粒物无机组分主要诱导细胞产生的应激模式为膜应激和蛋白应激，且在颗粒物无机组分浓度最高时，普遍应激反应强烈.各电场颗粒物诱导细胞应激模式的差异与自身沉降变化有关，1～4 号电场颗粒物采集按照从前到后的顺序，受重力作用后方电场颗粒物的粒径和密度变小，导致4 个电场颗粒物成分存在差异；同时，颗粒物有机组分和无机组分浓度的变化也会引起应激模式改变，主要原因是随着浓度的增加，颗粒物之间会发生碰撞、聚集和堵塞现象，这些相互作用会影响颗粒物的运动和沉积方式，导致应激模式的改变.通过分析电除尘器内各电场颗粒物的应激模式，能够准确揭示工业废气颗粒物毒性作用机制，对于理解不同电场颗粒物的毒性机制以及制定相应的治理措施具有重要意义，更好地实现工业废气的净化和环境保护.

3.3 电除尘器内颗粒物毒性终点推导

采用四参数非线性回归模型(4PL)拟合分析以TELItotal数据为基础的浓度-响应曲线(见图8).当应激程度足够高时，会对细胞导致不可逆损伤，可能会存在一个阈值，并且超过该阈值应激便转为损伤并最终发展成可观察的表型毒性，定义最大效应指标(TELImax)为该阈值.毒性终点EC-TELI1.5，即应激反应转化为毒性效应的临界暴露浓度.传统毒性终点半数致死浓度EC50(导致50%机体发生不利反应的浓度)以及2 种分子毒性终点数据如表1 所示.

表1 电除尘器内各电场颗粒物有机组分和无机组分毒性终点指标Table 1 Toxicity endpoint indexes of organic and inorganic components of particulate matter in each electric field of electrostatic precipitator

图8 电除尘器各电场内颗粒物有机组分和无机组分的浓度-响应曲线Fig.8 Concentration -response curves of organic and inorganic components of particulate matter in each electric field of electrostatic precipitator

由图8 和表1 可见，4 号电场颗粒物有机组分诱导细胞的应激表达最为迅速、灵敏，且毒性终点最小，为3.01×10-10mg/mL.在4 个电场颗粒物的有机组分中，2 号电场的TELImax值(3.161)最大，4 号电场的TELImax值(2.134)最小，与EC50结果一致，也说明4 号电场颗粒物有机组分是最可能诱导细胞出现表型损伤的.对于4 个电场颗粒物无机组分而言，4 号电场颗粒物的EC50最小，为4.47×10-4mg/mL；同时，4 号电场颗粒物无机组分诱导细胞的应激表达最为迅速，毒性终点最小，为8.44×10-6mg/mL，表明4 号电场颗粒物无机组分是最可能诱导细胞出现表型损伤的.综上，本研究中钢铁厂烧结机头电除尘器内各电场颗粒物有机组分毒性呈4 号电场˃3 号电场˃ 1 号电场˃2 号电场的特征，颗粒物无机组分的毒性呈4 号电场˃2 号电场˃1 号电场˃3 号电场的特征.电除尘器内各电场颗粒物的毒性差异主要是由于颗粒物在电除尘器中的分离和沉降过程导致不同电场中颗粒物成分可能有所差异所致.4 号电场为该电除尘器末电场，该处颗粒物代表电除尘器末端逃逸颗粒物的特性，大多轻细，其毒性最大表明对工业点源开展微细颗粒物深度治理的必要性.同时，按此方法可以快速、准确地将工业废气颗粒物的毒性按照大小排序，对深入推进工业废气颗粒物超低排放改造工作有实际意义.

4 结论

a)鉴于工业废气排放问题日益严峻，颗粒物毒性分析对维护环境和保障健康至关重要.为此，提出了工业废气颗粒物有机物和无机物的毒性分析预处理方法，消除了毒理基因组学方法应用于整体颗粒物毒性分析的主要障碍，基于酶标仪开展毒性测试，并利用基因热图分析、应激模式反应和毒性终点确定颗粒物的毒性作用机制，得到了一种能完成工业废气颗粒物整体毒性分析的方法，相较于传统毒理实验，该方法准确高效，且能更全面地阐述颗粒物毒性模式.

b)将毒理基因组学的方法应用于某烧结机头电除尘器内颗粒物的毒性变化规律分析，得到各电场受试颗粒物有机组分和无机组分毒性作用机制、分子毒性终点及毒性大小，并从毒理学角度说明了开展微细颗粒物污染深度治理、工业烟气超低排放改造工作的重要性.