成人接种2剂新冠灭活疫苗12个月后T细胞免疫应答特点

王静，李亚群，汪海燕，宋曜如，李静,3，王文鑫,3，万林钰，周春保，范兴*，王福生*

1中国科学技术大学附属第一医院，安徽合肥 230001；2解放军总医院第五医学中心感染病医学部/国家感染性疾病临床医学研究中心，北京 100039；3北京大学302临床医学院，北京 100039

新 型 冠 状(新 冠)病 毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)疫苗是预防新冠病毒感染(coronavirus disease，COVID-19)重症化及死亡的重要手段。截至2022年12月，全球范围内已接种疫苗130 亿剂次，其中1/4 为灭活病毒疫苗[1]。尽管接种灭活疫苗的人群基数大，但与mRNA 疫苗或腺病毒疫苗相比，关于灭活疫苗诱导的细胞免疫反应的研究较少。

当下流行的Omicron 毒株逃逸中和抗体的能力强，难以避免突破感染[2]，新冠病毒免疫应答的研究重点开始从保护机体免受感染(主要由抗体介导)转向降低机体感染后疾病重症化的风险(主要由细胞免疫介导)[3-5]。多项研究表明，T细胞在预防疾病严重程度方面发挥着关键作用[6-7]。与体液免疫相比，细胞免疫具有抗原表位保守及衰退速度慢等多方面的优势[8-9]。mRNA 疫苗只能诱导S 蛋白特异性T 细胞反应，灭活疫苗具有N、M、E 等其他抗原蛋白，从而能诱导更加广谱的特异性T 细胞应答[10-11]。既往关于灭活疫苗T 细胞应答的研究主要集中在接种疫苗后的短期效应上，且缺乏对抗原特异性T 细胞表型的详细分析[12]。为探究灭活疫苗诱导的SARSCoV-2特异性T细胞反应的特征及持久性，本研究分析了15名成年个体接种2剂灭活疫苗12个月后外周血中特异性T 细胞的水平及表型特点，并探讨了其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入来自解放军总医院第五医学中心2022 年4-6 月招募的15 名医护人员。纳入标准：(1)年龄≥18 岁；(2)接种过2 剂新冠灭活疫苗。排除标准：(1)对疫苗成分有过敏反应史；(2)既往有SARS-CoV-2感染史；(3)既往有精神疾病或药物依赖史；(4)不同意参与研究。本研究获得解放军总医院伦理委员会批准(审批号：2020-013-D)。所有受试者在采血前签署书面知情同意书。15 名研究对象的中位数年龄为26(23～45)岁；其中男4名，女11名；均无吸烟史、饮酒史及过敏史。所有个体均接种2 剂灭活疫苗，其中接种北京科兴灭活疫苗12名，北京生物灭活疫苗3名，2剂疫苗接种间隔28 d[13]，在接种第2剂疫苗351(342～408)d后，收集其外周静脉血，分析抗原特异性T细胞反应。

1.2 方法

1.2.1 外周血标本及淋巴细胞分离 用EDTA-K2 采血管(美国BD 公司)收集受试者外周静脉血8～10 ml，4 h 内 分 离 外 周 血 单 个 核 细 胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，室温环境下以2000 r/min离心10 min，吸取上清血浆保存于-80 ℃，下层部分与等体积PBS混匀后均匀铺于Ficoll淋巴细胞分离液上，调整升速及降速至最低档，以2500 r/min 离心20 min，吸取白膜层，补加PBS 至10 ml，充分混匀后，以2000 r/min离心15 min，洗涤细胞。计数后调整细胞浓度为5×106～1×107个/ml，加入1 ml 细胞冻存液，于液氮中保存备用。

1.2.2 活 化 诱 导 标 记 法(activation-induced markers，AIM)检测SARS-CoV-2 特异性T 细胞[14]将1×106个PBMCs细胞置于96孔圆底板中，S组、NS组分别加入5 μg/ml SARS-CoV-2 Spike、Non-spike 特异性肽池(附表，江苏南京金斯瑞公司合成)，加入100 μl无血清培养基(美国Thermo 公司)，2 h 后加入等体积含10%成人血清(北京科霖恩公司)的完全培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。将等摩尔量的二甲基亚砜(DMSO，德国WAK 公司)加入DMSO 组，作为阴性对照。24 h 后收集细胞，加入流式抗体CD14-BV510、 CD16-BV510、 CD19-BV510、 CD56-BV510、CD4-AF700、CD8-PerCP-Cy5.5、CD69-BV421、OX40-PE、CD137-APC、CD45RA-BV605、CD27-PECy7、CXCR3-APC-Cy7、CCR6-BV650、CXCR5-BV711(美 国Biolegend 公 司)及Fixable Viability Stain 510、CD3-BUV395、CCR7-BUV496(美国BD 公司)，混合均匀后于4 ℃孵育0.5 h进行表面染色，PBS洗涤，加入200 μl 含1%多聚甲醛的固定液固定细胞，并于24 h内置于FACS Symphony A5型流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 9.0.0 软件进行统计分析。计数资料以例(%)表示，组间比较采用卡方检验；连续变量以中位数表示，组间比较采用Wilcoxon 检验(配对数据)或Mann-Whitney U 检验(非配对数据)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 成年人接种2 剂新冠灭活疫苗12 个月后T 细胞应答水平 接种第2 剂疫苗后，与DMSO 组相比，大部分个体SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞反应水平升 高(S 组： 14/15， P=0.0001； NS 组： 15/15，P＜0.0001)。S 组 特 异 性CD8+T 细 胞 反 应 水 平 比DMSO 组 略 升 高(12/15，P=0.0463)，NS 组 特 异 性CD8+T 细胞反应水平与DMSO 组比较差异无统计学意义(12/15，P=0.0806)，故本研究主要研究CD4+T细胞免疫应答情况。相较于Spike抗原，Non-spike抗原表位同样也能诱导高水平的特异性CD4+T细胞反应(P＜0.0001，图1)。

2.2 成年人接种2剂新冠灭活疫苗12个月后抗原特异性T 细胞记忆表型特征 接种2 剂新冠灭活疫苗12 个月后，总CD4+T 细胞主要由中央记忆细胞(central memory，CM：CD45RA-CD27+CCR7+)、1 型效应记忆细胞(effector memory 1，EM1：CD45RA-CD 27+CCR7-)及3 型效应记忆细胞(effector memory 3，EM3：CD45RA-CD27-CCR7-)组成。与总CD4+T 细胞相比，抗原特异性CD4+T 细胞中CM 表型占比增加(S组：64.5% vs.32.8%，P=0.0001；NS组：60.6% vs.32.8%，P＜0.0001)，EM3表型占比下降(S组：2.6% vs.24.4%，P＜0.0001；NS 组：1.0% vs.24.4%，P＜0.0001)。Spike抗原与Non-spike抗原诱导的抗原特异性T细胞记忆表型差异无统计学意义(P＞0.05，图2)。

2.3 成年人接种2剂新冠灭活疫苗12个月后抗原特异性T 细胞分化亚群表型特征 接种2 剂灭活疫苗12个月后，总CD4+T细胞主要由滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell，TFH：CXCR5+)、1 型辅助性T 细胞(T helper 1，Th1：CXCR5-CXCR3+CCR6-)及2 型辅助性T 细胞(T helper 2，Th2：CXCR5-CXCR 3-CCR6-)组成。与总CD4+T细胞相比，抗原特异性CD4+T 细胞表型主要表现为Th2 及1/17 型辅助性T细 胞(T helper 1/17，Th1/17：CXCR5-CXCR3+CCR 6+)表 型，TFH 及Th1 表 型CD4+T 细 胞 比 例 较 低(TFH：S 组 为8.6% vs.18.7%，P=0.0006，NS 组 为5.3% vs.18.7%，P＜0.0001；Th1：S组为3.8% vs.24.3% ，P＜0.0001，NS 组为2.1% vs.24.3%，P＜0.0001)。Spike抗原与Non-spike抗原特异性CD4+T细胞亚群分化表型方面无明显差别(P＞0.05，图3)。

3 讨 论

SARS-CoV-2 突变株，尤其是Omicron 的出现从根本上改变了COVID-19的流行方式及防疫政策的制定。Omicron突变株能够逃避基于武汉原始毒株疫苗诱导的抗体中和能力[3-4]，而细胞免疫成为预防感染重症化的关键[15-16]。本研究发现，成年人接种2剂灭活疫苗12个月后，体内仍能检测到SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞，且Non-spike也可以作为优势抗原引起较强的抗原特异性CD4+T细胞反应。SARS-CoV-2特异性CD4+T 细胞以CM 及EM1记忆表型为主，暗示了其具有较强的维持能力；同时病毒特异性CD4+T 细胞大量富集Th2 及Th1/17 表型。总之，这些数据证实新冠灭活疫苗能诱导广泛且持久的抗病毒CD4+T 细胞反应，可能是在Omicron 毒株大流行的情况下减轻感染者疾病严重程度的关键。

本研究发现，灭活疫苗能够诱导强烈的Spike及Non-spike 抗原特异性CD4+T 细胞反应。除SARSCoV-2 病毒Spike 之外的抗原蛋白，如N、M、NSP3等，同样能诱导强烈的T 细胞反应，是诱导细胞免疫的重要抗原[17]。mRNA疫苗引起的抗原负荷较高，能诱导强烈的体液免疫，但mRNA 疫苗是针对Spike蛋白设计的疫苗，只能诱导Spike特异性的T细胞反应[18]。灭活疫苗具有较强的体液免疫效应，而诱导细胞免疫的能力较弱，但其具有SARS-CoV-2的所有抗原蛋白，诱导的T 细胞反应更广泛，具有与mRNA 疫苗相当的细胞免疫诱导能力[11]。本研究进一步证实了灭活疫苗接种者T 细胞反应的广泛性，提示其能在Omicron 疫情期间发挥重要的免疫保护作用。

有研究表明，SARS-CoV-2 感染康复者及健康个体在mRNA 疫苗接种后至少6 个月内能维持稳定的细胞免疫水平[9]。接种2剂灭活疫苗4个月后，健康个体体内T 细胞免疫反应水平随时间延长而下降，但在感染康复者体内诱导了持久的T 细胞反应[19]。本研究探讨了成年人接种2剂灭活疫苗后T细胞免疫反应的持续性，发现灭活疫苗诱导的CD4+T细胞免疫反应至少能持续12 个月，且以CM 及EM1 记忆表型为主，暗示了其具有很强的持续能力。目前国内正经历Omicron 毒株快速传播的时期，但感染者重症化比例及病死率都很低，这可能与灭活疫苗诱导的T细胞免疫反应有关[20-21]。

本研究发现，灭活疫苗诱导的T 细胞免疫反应主要是CD4+T细胞免疫反应。由于抗原递呈方式等方面的差异，灭活疫苗主要诱导CD4+T细胞免疫反应，而诱导CD8+T细胞免疫应答的能力较弱[11]。另外，与抗原特异性CD4+T 细胞相比，抗原特异性CD8+T细胞的衰减速度更快，在接种疫苗6个月后，大部分个体已不能检测到抗原特异性CD8+T 细胞反应[9]。

CD4+T细胞亚群分化受到TCR信号强弱及微环境中细胞因子的影响[22]。本研究发现，接种疫苗12个月后，抗原特异性CD4+T细胞以Th2及Th1/17为主。其中，高比例Th2 表型抗原特异性CD4+T 细胞的出现，可能是由于随着时间的推移，CD4+T细胞活化状态的改变以及CXCR5、CCR6、CXCR3 等标志物表达下调造成的，CXCR5-CXCR3-CCR6-表型的CD4+T 细胞中只有一部分表达Th2 相关效应分子[7,23]。Th1/17 表型CD4+T 细胞是一种中间分化态的细胞亚群，能够分泌Th1及Th17亚群相关的细胞因子，可能会通过分泌Th1 相关细胞因子，发挥抗病毒免疫反应的作用[24]。抗原特异性CD4+T细胞中这两个亚群的细胞是否具有相应的功能，仍需要进一步研究。

本研究尚存在一些局限性：一是仅检测了抗原特异性CD4+T细胞的水平及表型特点，疫苗接种后抗体水平、记忆B 细胞水平未研究；二是未排除其他冠状病毒感染，无法除外有交叉反应的个体；三是受试者样本量少，且只随访1 次，未能检测到基线及接种疫苗后T 细胞水平的动态变化，后续研究中可适当增加随访次数及样本量，以探索T 细胞的动态变化。

综上所述，本研究描述了成年人接种2 剂灭活疫苗后长期记忆性CD4+T 细胞的水平及表型特点。在Omicron 大流行的时期，大量接种灭活疫苗诱导的广泛且持续的CD4+T 细胞反应是免疫保护的关键。本研究为后续基于T 细胞免疫应答的新冠病毒疫苗开发提供了新的实验证据。