离子淌度质谱法在D-氨基酸修饰多肽研究中的进展

刘文静，陈雨欣，李 博

（中国药科大学药物分析系，江苏 南京 210009）

DAACPs 的研究早期仅限于在微生物的细胞壁和多肽类抗生素中，自20 世纪80 年代以来，约40 种内源性DAACPs 被发现[1]。DAACPs 常充当细胞间信号肽或毒素[2]，如非洲巨蜗牛的神经肽-Fulicin[3]、贝类的神经递质D-Leu 取代的Mytilus-FFRFamide 肽[4]、海兔的NdWFamide 异构肽[5]。从甲壳动物、漏斗网蜘蛛毒液、鸭嘴兽毒液、加州蝾螈、南美树蛙等不同物种的生物体中也分别提取出了DAACPs[6-7]。此外，异构性也被用于治疗性生物制剂的工程，其中D-氨基酸可有效降低对药物的免疫原性反应风险。市场上治疗性DAACPs 的例子包括用于治疗遗传性血管性水肿的冰剂依卡西肽和美国食品和药物管理局批准销售用于治疗继发性甲状旁腺功能亢进的泰卡肽等。但有时消旋化可能会造成我们不希望的结构变化，因此开发合适的方法验证治疗药物的肽/蛋白稳定性的方法是必要的[1]。而由于检测手段的匮乏，生物体中DAACPs 的种类、含量和生物学作用已严重被低估。

发现内源性DAACPs 的方法主要包括两个步骤：一是在生物样本中筛选候选DAACPs，二是对D-氨基酸残基进行定位[8]。由于DAACPs 与天然L-氨基酸组成的多肽分子量一致，传统的免疫分析法、色谱法等分离效率有限。且质谱法难以实现这类立体异构体的分析[9]。因此，需要额外的方法来实现质谱检测的立体选择性。离子迁移质谱（Ion Mobility-Mass Spectrometry，IM-MS）提出了一种不同于以往的立体异构体分析策略。在IM-MS 中，离子在惰性气体和外加电场的作用下，根据其与漂移气体CCS 的差异实现异构体分离。这一特点使其在各种异构体的分离都有所应用，本文着重介绍了IM-MS 在DAACPs 分离分析中的应用进展，以期为IM-MS 法分析DAACPs提供参考。

1 离子淌度质谱法基本原理

1.1 仪器构成

离子淌度质谱仪在离子源和质量检测器之间加入了漂移管，通过其两端的电场和漂移气体的共同作用实现分离。通常包括漂移时间离子迁移谱（Drift time ion mobility spectrum，DTIMS）、吸入离子迁移谱（Aspiration ion mobility spectrometers,AIMS）、差分离子迁移谱（Differential ion mobility spectrometers,DIMS）和行波离子迁移谱（Traveling wave ion mobility mass spectrometer，TWIMS）等[10]。离子迁移单元和质量检测器之间配以由锥体和离子透镜组成的接口[11]，通过不同的离子迁移单元和质量分析器的对接可以产生IMSn-MSm 型离子淌度质谱仪[12]。

1.2 分离基本原理

离子迁移质谱法根据气体离子的大小和形状来分离气体离子，从而区分各种碰撞截面值不同的构象异构体。分辨率（Rp）为IM-MS 区分离子的能力，其公式为式（1）：

式中：td是离子漂移时间；wh是在探测器上以最大强度的一半测量到的离子脉冲持续时间。

温度、压力、漂移气体组成、电场参数和待分析离子构象的灵活性均可影响分离过程，通过对仪器结构的修饰和漂移原理的改变也可显著提高其分离能力。

离子结构越紧凑，发生碰撞的机会越少，具有更快的漂移速度。施加较低电场时,漂移时间与CCS 存在一定的相关性，分离基本原理可以使用Mason-Schamp方程[式（2）]将测量的漂移时间转换为CCS 值：

式中：z 为离子的电荷状态；e 为基本电荷；N 为漂移气体的数密度；μ 为离子-中性漂移气体对的减质量；kB为玻尔兹曼常数；T 为气体温度；P 为实验压力；L 为漂移长度；E 为外加电场强度；td为离子通过漂移管所需时间。离子在漂移管中受库仑力和气体分子碰撞阻碍力的作用，其通过漂移管所需的时间（td）与K直接相关，而这取决于离子的形状、质量和电荷量。

CCS 并非真正的分子截面，而是一个平均所有几何方向和离子中性相互作用的观测特性[13]。将漂移时间转化为CCS 值，不仅可以用来推断对离子三维构象的信息，还大大提升了分析方法的可重复性[14]。

2 离子淌度质谱法的应用

D/L 构型转换不影响肽段本身和碎片的质量，离子碎片丰度的差异进行鉴别和定量会限制低丰度的异构体的测定[15]。而离子淌度质谱法已经开发了多种方法，为更多内源性DAACP 的发现奠定了一定的基础。

2.1 酸络合法

直接离子淌度质谱法中，DAACP 与天然多肽的碰撞截面差异不足，单个位点异构化肽段可能无法区分。可利用碱性氨基酸残基与一些酸类形成非共价结合物，放大异构体多肽之间的立体差异，增加淌度分离，可用于鉴定DAACP。酸的结构和配合物离子类型可显著影响分离效果。Zimnicka 等[9]使用TWIMS 法，以手性结构羧酸或磺酸的单酸、二酸改善含Arg 残基多肽的迁移，由于静电力作用，多肽的碱性基团和酸的配合物足够稳定，这一研究也为后续各种体系中的碱性氨基酸残基的计数和鉴定奠定了的基础[16]。

2.2 手性气体添加

手性离子淌度谱（Chiral ion mobility spectrum，CIMS）是在漂移气体中添加挥发性手性试剂提供不对称环境，以离子与手性气体的立体特异性相互作用分离鉴定DAACPs 离子。

Dwivedi 等[17]以（S）-（+）-2-丁醇为手性改性剂，分离阿替洛尔、丝氨酸、蛋氨酸、苏氨酸等手性化合物。发现手性修饰剂会降低迁移率，但对映异构体的迁移率变化存在差异。虽然缺乏对映体分离的具体数据，但该方法为DAACPs 的鉴定提供了方向。

2.3 溶剂添加剂

溶剂中加入添加剂可使形状紧密的离子分离。N-叔丁基羰基-O-苄基-L-丝氨酸作为移位试剂，在DIMS 中实现了氨基酸色氨酸和苯丙氨酸对映异构体的分离[18]。He 等[19]研究发现，在一定浓度范围内，甘油可影响牛血清白蛋白（BSA）空间结构，引起BSA 平均电荷和CCS 增加。这为DAACPs 分离方法的开发提供了一种思路。

2.4 金属离子

在溶液中加入金属离子，由于有些金属离子可以带多重电荷，可能会最大限度地改善分子的聚集状态，从而改变异构体的离子化模式，提高分辨率。Fouque等[20]观测了多肽WKYMVM 与K+结合后的金属离子化肽段，虽然峰值宽度几乎没有变化，但肽段中D-氨基酸的CCS 增加了0.9%（2.6 A2），而L-异构体的CCS 增加了1.6%（4.8 A2），使其在低扫描速率下实现完全分辨率（R=1.0）。

2.5 二聚体及寡聚体

Pang 等[21]用IM-MS 研究了achatin I 和皮素肽异构体的单体、二聚体和寡聚体，发现二聚体的淌度差异较单体更大，表明二聚体和寡聚体在一定条件下增强了多肽异构体分离差异。

2.6 基于仪器自身改造的D/L-异构体分辨率提高的策略

DTIMS 最早出现，其分辨率约在60 左右。TWIMS则在更小的仪器结构中实现与DTIMS 相似的分辨率。经过几代发展，无损离子淌度仪（Structures for Lossless Ion Manipulations，SLIM）可以在较低气压下工作，在射频聚焦电场的辅助下，离子可以在SLIM 中稳定存储数小时，并实现近乎无损的传输，提高检测灵敏度[22]。高分辨环状离子淌度仪也是TWIMS 的一种，可在漂移管中多圈扫描，将离子分辨率提高至200 左右[23]。DIMS 通过高低电场周期性交替使带电粒子在电极之间锯齿状运动，并通过离子迁移率对非线性电场的依赖性而产生分离，但灵敏度较低。捕获式离子淌度质谱（Trapped ion mobility spectrometer，TIMS）设备以紧凑的形式提供R 高达400，且易与各种质谱组合。

离子淌度质谱仪的分辨率依赖于其工作原理、漂移管结构以及长度，通过仪器原理和硬件结构的变迁，能够有效地改善其迁移率，从而提高DAACPs 的分辨率。

3 IM-MS 数据处理策略

3.1 三维手性鉴定平台

D/L-异构体在商业IM-MS 仪器上的分辨能力仍是关键的限制因素。虽在近几年已取得了实质性进展，发展快速和有效的分析策略来进行光学不纯肽异构体的结构鉴别仍是研究重点。在无法快速更新仪器硬件的情况下，多维手性差异放大和多维分离技术的应用十分必要。

Li 等[24]开发了基于金属离子结合的多维手性剖析平台（iCAP）,通过对金属结合配合物在三维空间中的CCS 值的三维散射，使数据可视化，同时解决了三个挑战：通过金属离子增强多维异构体鉴别；利用生长曲线直接读出Aβ 片段齐聚过程，并评价齐聚过程中的手性效应；基于碰撞诱导展开（CIU-IM-MS）测量和基于表面等离子体共振（Surface plasma resonance，SPR）的动力学分析，可靠地可视化手性识别诱导的受体结构变化。三维分析具有更好的空间分布，随着待测离子与铜离子结合量的增加使分离尺寸增加，D/L-异构体之间的分离效率显著提高[25]。

3.2 CCS 值查询与预测

目前CCS 查询和预测方法主要包括机器学习和理论计算两种方式。

3.2.1 机器学习

CCSbase 是一个综合平台，包括CCS 测量数据的综合数据库，以及高质量和高通量CCS 预测模型。通过使用基于MQNs 的无监督聚类对化学结构多样性进行分解，可以训练出每个聚类的特定和准确的预测模型，这优于使用所有数据训练的单一模型的性能。可对不同的化学结构进行高精度的CCS 预测模型的稳健训练和描述[14]。

MetCCS predictor 的功能包括CCS 值预测、MetCCS 数据库搜索和代谢物匹配功能，只需导入一种代谢物的7 个及以上数量常见分子描述符就可在几秒钟内预测出CCS。Zhou 课题组[26]开发了一种采用支持向量回归（SVR）算法预测代谢物CCS 值的方法，预测精确度在3%左右，优于理论计算法，但该方法目前还不支持在多肽和蛋白中的应用。

CCSondemand 软件是Waters 联合推出的一款机器学习软件，可用于模拟潜在代谢物结构并获取理论CCS 预测值，有助于进一步了解代谢物结构。

3.3.2 理论计算类

理论驱动的方法通常使用分子建模来产生分子的三维和电子结构的近似，然后通过模拟漂移气体和分析物离子之间的相互作用计算CCS 值。这些方法的好处是植根于坚实的理论原理，但根据细节的程度，计算可能变得非常费时和费力[27]。此外，根据所选方法的理论所做的假设，也可能会引入系统误差，并且在不引入偏差的情况下很难进行纠正。CCS database 是一种基于理论计算的CCS 查询工具，含3334 个化合物，但无预测功能[28]。Colby 等[29]开发的ISiCLE 通过使用分子动力学、量子化学和离子淌度计算来生成结构和化学性质库，大大提高了计算效率的数量级，且优于其他基于密度泛函理论（Density Functional Theory，DFT）的方法和机器学习方法。

4 基于IM-MS 的DAACP 修饰位点鉴定策略

IM-MS 不仅可以实现异构体肽段的分离，还可鉴定D-氨基酸残基位点[30]。多肽异构体首先被LC分离，借助CID 产生y+和b+碎片离子，以碎片离子的淌度漂移时间偏移作为D-氨基酸残基确定的标准，实现修饰位点的鉴定。

Jia 等[8]将该消旋化位点策略应用于美洲龙虾中的CHHs 肽生物样本鉴定，通过IMS 的差异信号放大作用，鉴定到D-氨基酸位于末端的苯丙氨酸。

5 基于IM-MS 的DAACP 定量策略

离子淌度质谱法在含量测定中也有所应用。Guo课题组[31]采用IM-MS/MS 技术研究了电喷雾电离下亮氨酸和异亮氨酸的电离行为与其原单体之间的定量关系。结果表明，羧基质子化离子的丰度与氨基酸浓度成正比，可用于定量分析。Dittmar 等[32]采用TIMS-Q TOF MS 进行靶向肽定量方法研究，通过正交分析，在30 min 内检测到了大约200 个肽，并且成功量化了添加在HeLa 细胞提取物中的合成肽。

6 总结与展望

IM-MS 为化合物立体异构体分析提供了一个额外的维度，其在DAACPs 分离检测中具有独特的优势，不仅为具有一定生物活性的DAACPs 发现提供了可行的检测手段，也有望为某些疾病的生物标志物的发现，以及蛋白质多肽类药物中DAACPs 的研究奠定基础。虽然目前，IM-MS 仪器的更新换代已经很大程度上改善了异构体的分离，然而这种分离度的提高是在牺牲一定的检测灵敏度的基础上的，因此仍需要不断地优化仪器的原理和结构，以同时满足灵敏度和分离度需求。