基于基因工程改良的植物修复土壤重金属的应用

张靖伟，李鑫鑫

（青岛科技大学环境与安全工程学院，山东青岛 266061）

0 前言

近年来，由于时代发展所遗留的大量重金属污染问题，农业、工矿业和废弃资源地的生态环境质量问题日益凸显，土壤质量持续下降。中国的土壤重金属污染的面积目前已累计超过了千百万公顷，且正逐步地呈现转化为具有多重土壤污染源、污染物浓度差异大、污染区域面积分布广、污染时间持续稳定时间长、危害性极强等环境特点。植物可以通过植物提取来去除土壤中的污染物，然后收获进行加工。研究结果表明，这些技术可能成为替代机械和化学方法在金属污染土壤修复中的可行方法。

用基因工程改良植物为金属污染土壤的植物修复开辟了新的可能。然而，只有更好地理解金属耐受、积累和转运的机制，才能充分使用这种方法[1]。

1 重金属的植物吸收

1.1 超积累植物

耐金属和超积累的植物种群可以在自然存在的富含金属的地点发现。但由于这些植物通常体积小，生物量产量低，故不适于植物修复。相比之下，生长良好的植物通常表现出较低的金属积累能力和较低的重金属耐受性。

适合用于植物修复的植物应具有以下特征：①可积聚拟提取的金属；②金属累积的高耐受性；③生物量大；④易于收获。

根据Chaney 等人(1997)，对于有效的植物修复研究进展，由于其土壤和植物的独特化学性质，每个元素都必须单独考虑。另一方面，金属很少单独存在，可能需要同时对几种金属进行适应性耐受性的研究[2]。

1.2 改变金属耐受性或吸收能力的基因工程植物

1.2.1 能够进行汞离子植物修复的植物

细菌可将一些重金属毒性降低。革兰氏阴性菌的汞抗性由一个操纵子编码，该操纵子包括5 ～6个基因，其中一个汞离子还原酶基因（merA）将有毒的Hg2+转化为毒性较小的金属汞（Hg0）。表达merA 基因的大肠杆菌细胞除还原Hg2+外，还具有弱的还原Au3+和Ag+活性。merA 基因也微弱地增加了酿酒酵母对Hg2+的耐受性。这些研究表明，merA 可能是一个在植物中表达金属耐受性的基因。（1996）构建了诱变的merA 序列（merApe9），修改了9%的编码区，并将其转化为拟南芥。尽管转基因植株只表达了低水平的merA mRNA，但种子在含100 mm Hg 的培养基上发芽和幼苗生长。与对照植物相比，转基因幼苗进化出的Hg0含量是后者的2 ～3倍。植物对有毒水平的Au3+也有抗性[3]。

1.2.2 对金属硫蛋白和镉具有耐受性的植物

植物中的金属硫蛋白和植物螯合素含有高比例的半胱氨酸巯基，它们以非常稳定的配合物结合和隔离重金属离子。植物螯合素具有高亲和力结合铜和Cd，可被各种金属诱导。

植物螯合素可能对植物耐镉性起作用。Howden和Cobbett（1992）分离出了对Cd 敏感性增加的拟南芥突变体，但对铜的耐受性几乎没有变化。

金属硫蛋白与Cu、Cd 和Zn 结合可调节细胞内锌浓度，并调控高浓度的Cd 和Cu 。拟南芥中MT的表达与Cu 的耐受性相关，而与Cd 的耐受性无关。各种MT 基因——小鼠MTI、人类MTIA（α域）、人类MTII、中国仓鼠MTII、酵母CUP1、豌豆PsMTA——已转移到nictiana sp.Brassica sp.或a.t aliana。它们在不同程度上增强了对Cd 的耐受性，与对照相比最大提高了20倍。金属摄取没有明显改变；在某些情况下，在其他品种中，茎或叶吸收Cd 最多减少70%或增加60%。只有一项研究报道了用植物源MT 产生的转基因植物。

当豌豆（Pisum sativum） MT-like 基因PsMTA 在A.thaliana 中表达时，与对照植物相比，转化植株根部积累的Cu 更多（部分植株数倍）（Evans et al. 1992）[4]。

1.2.3 铁蛋白和增加铁浓度的植物

铁蛋白是一种储存铁的蛋白质，存在于动物、植物和细菌中。它由24个亚基组成，可在胶束中包围多达4 500个铁原子。可以防止铁/二氧相互作用产生的自由基造成的损害。铁蛋白已被发现为治疗大鼠贫血提供铁源。由此提出，通过转基因提高谷物铁蛋白含量可能有助于解决膳食缺铁问题。

1.2.4 与植物修复相关的微生物作用

与植物地下生物量相关的微生物群在有机异种生物的解毒中起着关键作用。微生物在降解异种生物中很重要，因为它们的作用严格地与植物修复相关，而不是与无机物质相关。内生细菌是根系微生物群的重要组成部分，有助于植物对有机污染物的修复，在这方面，4种内生微生物能够将修复柴油污染土壤中的石油碳氢化合物的毒性影响降至最低。然而，在这些内生微生物中，假单胞菌被观察到在微生物辅助植物修复土壤中的石油碳氢化合物方面最为成功。在碳氢化合物修复的背景下，一对基因（例如CYP153和alkB）已被鉴定为具有抗应力性。在假单胞菌sp 中，除了这些基因外，nah、pah 和phn 还能够增强微生物辅助植物修复。

就成本效益和生态友好性而言，用微生物(例如植物内生细菌和根际细菌)进行的植物修复是有机物的最佳酶生物降解方法。有趣的是，假单胞菌菌株中涉及修复的基因编码酶存在于质粒上，即染色体外DNA。基因工程菌株(即洋葱伯克霍尔德菌)可以降解对健康有害的除草剂(例如橙剂)。来自根瘤菌的几种革兰氏阴性固氮共生细菌(22株根瘤菌，如菜豆根瘤菌)已被初步鉴定为能有效修复儿茶酚和水杨酸等酚类物质。结果表明，该方法能有效地利用黑根菌修复多氯联苯（＞70%）。

多芳烃因其致癌、致突变和致畸作用而对环境/人类健康有害。细菌和根际内生菌可以很容易地用于植物修复多环芳烃，而基因工程可以提高其效率。通过根际/微生物工程优化植物-微生物相互作用，存在植物修复协同效应。在芳香族有机物的植物修复中，根瘤菌共生菌群利用有机分解中间体作为C/N 资源。有趣的是，某些微生物毒素也可以作为协助根瘤菌修复的资源，因为它们可以作为C/N 资源，正如在超蓄积物菌株中观察到的那样。在转基因植物中，编码ACC 脱氨酶（acdS）的细菌基因的表达可以降低乙烯施加的胁迫浓度，从而促进植物生长。因此，所选转基因植物丰富的生物量可以显著提高植物修复潜力。此外，这种转基因植物也有助于内生菌的定植[5]。

1.3 提高金属耐受性或积累能力的潜在基因

一些技术因素限制了植物基因工程在植物修复中的应用。其中一个主要因素是，只有少数植物系统具有足够的抗金属和/或金属隔离特性可用于修复。从细菌中提取基因并将其转移到植物中是很复杂的，例如，抗性通常是由一个含有许多参与抗性机制的基因的操纵子的大质粒编码的。到目前为止，只有来自这种操纵子的单个基因被转移。

超积累植物是适合植物修复的基因的良好来源。人们已经发现了数百种这样的植物，其中一些超蓄能型植物已被用于非基因工程的植物修复。然而，对芥菜的研究表明，金属生物利用度是铅提取的主要问题。因此，在土壤中添加EDTA 以提高铅的有效性；然而，这可能会对环境造成威胁。如果可以通过增加还原酶活性或螯合剂的用量来局部提高金属利用率，这些超蓄能植物就可以安全地用于植物修复[6]。

1.3.1 研究高或低金属浓度接触下的生物体

现代蛋白质组学和DNA 阵列技术可用于植物修复候选基因/蛋白质。金属胁迫诱导的一些蛋白质可能在金属耐受或金属积累中起作用。谷胱甘肽在保护植物免受Cu 和Cd 侵害方面起着关键作用。Ernst（1976）观察到在耐锌和耐铜植物中苹果酸含量较高，枸橼酸含量增加，超积累植物大量装载这些酸，酸阴离子可能在金属储存或植物内部金属运输中起一定作用。在积累镍的植物木质部分泌物中，已发现游离组氨酸是一种金属螯合物，在接触镍时，游离组氨酸的数量增加。通过改变组氨酸代谢，有可能提高植物积累镍的能力。在过去的几年里，已经从拟南芥中分离出了几种金属转运蛋白，锌转运蛋白ZIP1, 3,4，铁转运蛋白IRT1和铜转运蛋白COPT1。一些转运蛋白如ZIP1、ZIP3和IRT1在金属缺乏反应中表达。IRT1也可能在其他金属的吸收中发挥作用，因为Cd、Zn、Co 和Mn 抑制了IRT1 对Fe 的吸收。改变这些转运蛋白的表达调节可能会以一种有用的方式改变细胞或细胞器对金属的吸收

1.3.2 金属抗性和敏感植物突变体候选基因

最近，从拟南芥中分离到几个对重金属反应改变的突变体。Howden 等人已分离出植物螯合酶缺陷、g-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶缺陷的镉超敏突变体。Chen 和Goldsbrough（1994）发现，在选择耐镉的番茄细胞中，g-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性增加。这些基因中的一些可能被证明在修饰合适的目标植物以进行植物修复方面有用，尽管对参与植物螯合蛋白合成的基因的有用性存在怀疑。

2 转基因植物修复土壤重金属

众所周知，植物生长需要许多金属作为必需的微量营养素，但过量的这些金属会导致植物生长抑制、土壤质量退化、作物产量减少、农产品质量差，并对人类、动物和生态系统造成重大危险影响。重金属在环境中的长期存在加剧了其对人类和动物健康的威胁。例如，作为持久性较强的金属之一，Pb 在土壤中的滞留时间估计为150 ～5 000 a，据报道，在污泥施用于土壤后，Pb 的高浓度可维持长达150 a。据估计，铅在人体内的平均生物半衰期为18 a，一次为10 a。金属还可通过食物链转移和积累在动物和人体内，通过其诱变能力造成DNA 损伤和致癌作用。

遗传和生物化学基础是基因工程的一个有趣的目标，因为对分子遗传学模式生物的了解可以增强对植物金属代谢基本成分的认识。对正常植物和金属超蓄能体的吸收和转运过程、这些活动的调控以及组织特异性启动子的使用的基本了解，为科学家利用分子生物学工具开发有效和经济的土壤金属植物修复植物提供了巨大的希望（Chaney 等人，1997）。一些植物，如杨树、烟草或丝莲（cucubalis），经过基因工程，可以过度表达谷氨酰半胱氨酸合成酶，从而与相应的野生型植物相比，可以增强重金属的积累。

迄今为止大多数转基因植物过于依赖参与金属结合蛋白和多肽生物合成表达的基因，基因可以将有毒离子转化为毒性较小或更容易处理的形式，或两者的组合，至少可以设想3种不同的增强金属吸收的工程方法，包括增加吸收位点的数量，改变吸收系统的特异性以减少不需要的阳离子的竞争，以及增加细胞内结合位点。

3 转基因植物的应用前景

植物的分子组成，主要与它们的酶和蛋白质有关，是植物修复的重要内容，因为该技术可以利用基因工程工具，利用植物的分子和细胞机制来解毒。植物的性质仍然是一个优势，因为随着时间的推移，它们能够发展出吸收养分、排毒污染物和控制当地地球化学条件的复杂机制。植物在调节土壤含水量方面起着重要的作用，避免了液体的渗透，这是污染物进入土壤的主要机制。植物根系补充微生物养分，为土壤提供通风，使土壤微生物数量较无植被区增加。最重要的是，植物修复比其他物理修复手段具有更好的美学吸引力。另一方面，植物修复有一些局限性，需要进一步深入研究植物和土壤条件。一个主要的缺点是这种解毒方法太慢或只在季节性有效。监管机构通常要求在短短几年内在修复方面取得重大进展，这使得大多数植物修复不适合。在许多情况下，如三氯乙烯和四氯化碳，污染物的浓度降低不令人满意。此外，在一些污染场地，污染物可以达到植物毒性浓度，使植物无效。因此，最近开展了一些旨在利用基因工程提高植物修复潜力的研究。

4 结论

有机或无机污染物因其对环境和生物的影响而具有重要意义。因此，如何控制污染是极具意义的。人们在确定植物种类及其在这些地方更有效的解毒机制方面作出了巨大的努力。利用基因工程工具，通过在可用物种中鉴定特定基因，并将基因传递给其他植物，显著提高。这可以通过提高成本效益更有效地提高污染修复成本。生物和植物，有特定的方式来清除、滞留或转化特定的污染物。研究土壤与微生物、植物和污染物之间的相互作用及其后续评价是非常必要和具有指导意义的。综合考虑，在这方面还需要开展更多的研究，以更好地了解生物的植物修复能力，以及通过植物转化技术在防治污染方面的应用。