脂肪间充质干细胞在纤维化疾病治疗中的作用

王扶凝，代会博，唐 蕾，单 云，盛梅笑

南京中医药大学附属医院肾内科，江苏 南京 210029

纤维化是纤维结缔组织在组织器官内广泛沉积的动态过程，其特征为胶原蛋白等细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的积累。机体在感染、炎症、自身免疫、退行性病变、肿瘤和损伤等各种触发因素下，启动一系列修复过程［1］。如果组织损伤严重或反复受损，修复过程会演变为进行性不可逆的纤维化反应，成纤维细胞持续激活，ECM过度合成，导致器官组织被结缔组织所取代，功能丧失［2］。肝硬化、肺纤维化、肾间质纤维化、心肌梗死、系统性硬化症、移植物抗宿主病等各种疾病的纤维化重塑可损害器官功能，甚至导致器官衰竭，严重威胁人类生命健康［3］。因此，探寻纤维化的发生机制和抗纤维化的有效治疗方法一直受到关注。

脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cell，ADSC）是一种来源于脂肪组织、具有自我更新及多向分化能力，在体外和体内均具有抗炎、抗凋亡、调节免疫、促进再生等特点的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），在一系列纤维化疾病的治疗中均表现出巨大的潜力［4-8］。本文就近年来ADSC在纤维化疾病中的治疗作用和机制进行综述。

1 ADSC概述

ADSC 是皮下脂肪组织通过酶促消化获得的、具有增殖和分化能力的MSC。MSC 最早在骨髓中发现，也存在于脐带、脂肪、羊膜、牙髓等多种组织器官［9］。2006 年国际细胞治疗学会提出定义MSC的3 项基本标准：①塑性黏附；②表达分化簇（cluster of differentiation，CD）73、CD90 和CD105，不表达CD11b、CD14、CD19、CD45 和人类白细胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）；③有成骨分化、成脂分化和成软骨分化的潜能［10］。MSC分泌多种趋化因子、细胞因子和ECM 蛋白，参与多种生物学过程，包括造血、血管生成、白细胞运输、免疫和炎症反应。基于MSC 的免疫调节作用及低免疫原性，无需免疫抑制即可进行同种异体移植，其在组织工程和再生医学研究领域受到广泛关注。而脂肪相比胎盘、羊膜、骨髓等组织来源更丰富，便于提取，易于获得较多细胞，且供体创伤小、可自体移植、安全性高，被认为是MSC 临床应用的理想来源［11］。与最经典的骨髓来源的MSC相比，ADSC增殖能力更强，且在生物活性因子分泌方面更活跃，能分泌更多的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等，具有更好的促血管生成和再生修复能力［12-13］。

2 ADSC对组织纤维化的干预作用与机制

早期研究人员认为纤维化不可逆转，但近年来动物研究和临床试验均表明，纤维化是一个高度动态变化的过程。因此，探索纤维化的发生机制，寻求新型抗纤维化治疗手段具有重要意义。在痤疮及烧伤瘢痕的临床研究中发现，皮内注射ADSC 及其条件培养液（ADSC condition medium，ADSC-CM）可减轻瘢痕严重程度及瘢痕面积占比，改善患者的皮肤弹性［14-15］。慢性阻塞性肺炎患者肱静脉自体输注ADSC，炎症相关C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）下降，气道纤维化重塑减轻，肺顺应性提高，肺功能有所改善［16］。一系列临床实验表明ADSC安全且疗效确切，其对组织纤维化的具体干预作用与机制涉及以下几个方面。

2.1 阻抑上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT参与器官发育与伤口愈合，也是癌症和组织纤维化等疾病发展的重要环节。在EMT过程中，上皮细胞间连接丢失，细胞与基质失去相互作用，上皮标志物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）、细胞角蛋白（cytokeratin）、紧密连接蛋白-1（zonula occludens protein-1，ZO-1）减少，进而表达N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等间充质标志物［17］。ADSC-CM可改善转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β 所致的上皮标志物E-cadherin、ZO-1表达减少，下调N-cadherin［18］，并有效抑制香烟烟雾提取物诱导的人肺上皮细胞死亡，减轻肺纤维化。ADSC 还分泌包含微小RNA（microRNA，miR）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的外泌体（exosome，Exo），通过细胞间的物质交换参与调节纤维化进程。在小鼠子宫内膜纤维化模型中，宫腔内注射ADSC-Exo，其包含的lncRNA-MIAT与子宫内膜上皮细胞中的miR-150-5p结合，抑制α-SMA 表达，缓解纤维化。此外，在体外角膜上皮重建中，ADSC 可以通过间充质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET）衍生出上皮祖细胞［19］。在完全膀胱切除术后植入含ADSC的去细胞化膀胱基质，能够在小鼠体内诱导内源性尿路上皮细胞再生［20］。这些研究表明，ADSC可通过转分化及旁分泌作用，抑制甚至逆转EMT，促进组织器官原有结构和功能的恢复。然而，在肿瘤微环境中，ADSC 可能促进癌细胞EMT，参与肿瘤细胞的迁移和侵袭［21］，对癌症患者的治疗安全性还有待探究。

2.2 抑制成纤维细胞活化

在慢性炎症或反复组织损伤的环境中，成纤维细胞对ECM合成、降解、重塑的调节失衡，活化为产生ECM 的肌成纤维细胞［2］。肌成纤维细胞在纤维化疾病中起重要致病作用，众多抗纤维化研究均通过靶向抑制成纤维细胞活化来发挥效应。TGF-β1是成纤维细胞活化为肌成纤维细胞的关键介质［22］。研究发现，大鼠静脉注射ADSC可降低受损肝脏、肾脏或生殖器海绵体组织中的TGF-β1以及Ⅰ型胶原的表达［23-25］。在人瘢痕疙瘩组织的离体培养中也发现，ADSC-CM 抑制TGF-β/Smad 及p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信号转导通路，减少成纤维细胞活化，改善胶原沉积［26-28］。ADSC-Exo 中的miR-192-5p 可直接靶向成纤维细胞中的白介素-17 受体A（interleukin-17 receptor A，IL-17RA），通过抑制其下游Smad通路磷酸化，抑制成纤维细胞活化［29］。同时，ADSC-CM还通过环氧合酶-2/前列腺素E2（cyclooxygenase-2/prostaglandin E2，COX-2/PGE2）级联反应，抑制活化的瘢痕成纤维细胞增殖并促使其凋亡［30］。口腔黏膜纤维化的研究中也发现，过表达ADSC-Exo 中miR-375可增强对纤维化颊黏膜成纤维细胞中转录因子活性的抑制，促进细胞凋亡以抑制纤维化进程［31］。ADSC 对成纤维细胞存在双向调节作用。在伤口愈合早期，ADSC会促进成纤维细胞的增殖迁移及胶原蛋白的合成，并分泌VEGF等促进血管形成以加速创面愈合［32-33］，但在愈合后期或炎症、射线等促纤维化条件下，ADSC 能阻止成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，抑制肉芽组织形成，调节基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达［34-35］，抑制胶原沉积［36-37］，起到抗纤维化的作用。此外，ADSC升高肿瘤坏死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6）水平，抑制肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化的同时可促使其表达EPCAM、CD133等肝脏谱系标志物，诱导HSC向肝祖细胞转化。

2.3 参与抗炎及免疫调节

组织损伤和炎症是再生与纤维化的重要触发因素。随着各种不同类型的炎症细胞如巨噬细胞、T 细胞、肥大细胞等的招募和激活，炎症反应被放大，进一步加速纤维化进程。因此，抑制炎症反应是抗纤维重塑，促进损伤后组织结构恢复的重要途径［38］。

2.3.1 巨噬细胞

目前研究认为，巨噬细胞M1型向M2型转化可以改善纤维化。M1型巨噬细胞促炎并产生TGF-β1、IL-1β等促纤维化介质，M2 型分泌IL-10 和精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）等促进炎症消退［39-41］。ADSC 可通过调节巨噬细胞激活状态，促进巨噬细胞M1 型向M2 型转化，对抗纤维化相关组织损伤，这在梗死后心肌重塑研究中已有报道［42］。一项人类皮肤光老化的前瞻性研究中发现，ADSC 可增加M2型巨噬细胞数量，抑制炎症［43］，且这种调节作用在肥胖个体中更加显著。通过抑制Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）及其下游信号转导，降低核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的DNA 结合活性，ADSC 抑制M1 型相关促炎分子，如细胞因子TNF-α、NO 的合成［44］。另有研究比较了脂肪与骨髓来源的MSC 对腹膜透析诱导的腹膜纤维化的治疗作用，发现ADSC促M2型巨噬细胞极化作用更显著而具有更好的治疗效果，这基于ADSC在TGF-β1刺激下分泌更多的IL-6［45］。这种MSC来源的IL-6在促调节组织稳态的同时，提高组织的修复活性，促进去分化及再生［46］。此外，ADSC 在体内的长期免疫调节作用与巨噬细胞的吞噬清除功能相关，巨噬细胞摄入凋亡的ADSC 后产生抗炎介质，而巨噬细胞耗竭和IL-6 阻断均抑制ADSC 的治疗效果［47］。

2.3.2 T细胞

先天性免疫和获得性免疫都参与了纤维化的形成，调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）参与免疫稳态的调节，一般认为Treg 抑制纤维化的发生；Th1 细胞产生干扰素（interferon，IFN）-γ抑制成纤维细胞诱导的胶原蛋白合成并减轻纤维化，也被认为在很大程度上起着抗纤维化作用［48］，而其他表型Th17 型与Th2 型细胞多被认为对纤维化有促进作用［49］。因此，T 细胞的表型转化与平衡也是ADSC 抗纤维化的潜在机制。在博莱霉素诱导的小鼠肺损伤模型中，尾静脉注射ADSC 可以抑制小鼠Th2型CD4+T细胞的分化和增殖，促进Treg细胞的分化和增殖，减少肺纤维化面积，改善预后［50］。通过体外共培养人ADSC 与外周血单核细胞发现，ADSC 通过程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）和T 细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3）途径抑制T 细胞中的NF-κB 活化，剂量依赖性调节Th1/Th2/Treg 细胞亚群转化，起到免疫抑制作用［51-52］。除细胞间接触外，ADSC 还通过分泌PGE2、IDO 等因子［53］，介导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制，或通过线粒体转移上调下游FoxP3、CTLA4、GITR 等mRNA 水平，诱导Treg 细胞分化，促进Th17/Treg 间平衡的恢复［54］。此外，在克罗恩病肛瘘的临床试验中发现ADSC 在调节T 细胞的同时不增加感染风险，优于免疫抑制剂［55］，为炎症相关纤维化的治疗提供了新的思路。

2.3.3 肥大细胞（mast cell，MC）

随着研究深入，MC 也被证实与纤维化的发生有关［56］。特发性肺纤维化患者活检标本中，MC 数量与纤维化病灶之间呈显著正相关，与患者肺功能呈负相关，因此被视为潜在的治疗靶点［55］。一项关于皮肤瘢痕的临床试验也证实，MC数量与人体皮肤瘢痕形成情况呈正相关［57］，阻断MC 脱颗粒，可减小瘢痕大小，改善伤口组织的胶原结构及密度。作为皮肤中的免疫哨兵，MC 对各种病理和环境刺激的反应与Toll样受体等多个分子通路及其他免疫细胞相关。间质性膀胱炎大鼠黏膜下层注射ADSC，可下调TNF-α、IFN-γ、MCP、IL-6、TLR2 和TLR11 等炎症因子水平，抑制MC 浸润和上皮细胞凋亡，促进受损膀胱再生［58］。皮下注射ADSC 诱导Th17 细胞下调IL-17 分泌，减少小鼠皮肤中MC 浸润，改善炎症反应［59-60］。此外，ADSC 还通过COX2 依赖性机制抑制B 细胞IgE 的释放，减少MC 富集和激活，并通过上调前列腺素相关受体，减少IgE受体表达，抑制IκB-α降解以降低MC 中的NF-κB 活性，抑制MC活化［61］。

4 结语

ADSC 来源丰富，易于获取，分泌多种细胞因子，参与免疫调节和组织再生，在多项临床试验中显示出治疗优势，在纤维化相关疾病中也具有临床应用前景，已被证实可通过阻抑EMT、抑制成纤维细胞活化、调节免疫等多个途径治疗纤维化。同时，以ADSC-Exo 为载体，构建靶向递送系统，也为纤维化疾病的治疗提供了新的方向。然而，ADSC可能促进肿瘤的进展和转移，其是否适合肿瘤微环境下的移植治疗仍然值得讨论。此外，ADSC促血管生成在不同纤维化环境下的影响尚有争议，ADSC抗纤维化作用的时间依赖性及作用间的串扰等也有待进一步探索。