miRNA-375 在食管鳞状细胞癌中的研究进展

马永明 ，耿玉涵, ，孙敬阳 ，金刚，杨毅，刘佳伟，马龙 ，朱自江

1 甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000

2 甘肃省人民医院胸外二科，兰州 730000

3 宁夏医科大学第一临床医学院，银川 750004

食管癌是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病率和病死率分别居全部恶性肿瘤第7位和第6 位，患者的5 年生存率为15%～20%[1]。食管癌的预防措施及其临床管理因组织学亚型不同而不同，食管癌的两种主要组织学亚型是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）[2]。ESCC 是食管癌最常见的组织学类型，起源于食管的鳞状上皮细胞。近年来在西方国家，起源于食管和胃交界部EAC 的发病率和病死率均在上升[3]。据统计，全世界的食管癌患者约半数在中国[4]，发达国家以EAC 为主，发展中国家以ESCC 更为常见，在中国，ESCC 一直是主要的组织学亚型[5]。食管癌的危险因素包括吸烟、饮酒、不良饮食习惯（食用加工肉类、热饮热食、食用腌制蔬菜等）、营养素缺乏（包括维生素以及矿物质锌、硒、钼等缺乏）、感染、家族遗传等[4]。ESCC 的危险因素包括男性、家族吸烟、饮酒、不良饮食习惯及不良口腔卫生。食管癌早期通常无症状或症状比较轻微，大多数患者确诊时已发展至晚期，因此，食管癌患者的5 年生存率仍不理想[6]。目前食管癌检测和筛查方法的特异度及灵敏度均较低，无法满足临床检测及治疗需求，需要寻求更多的生物标志物来进行早期预测、辅助诊断、临床治疗和预后评估。微小RNA（microRNA，miRNA）-375 作为miRNA 家族重要的一员，参与包括食管癌在内的多种肿瘤的发生过程，通过调控原癌基因和抑癌基因的表达，在肿瘤细胞的分化、增殖、微环境改变、凋亡、迁移和侵袭等过程中扮演极其重要的角色。本文总结miRNA-375 在ESCC 发生发展中的作用及靶向调控机制，旨在为ESCC 的临床诊断、治疗方案制订及预后评估提供参考依据。

1 miRNA 的起源

miRNA 是一类高度保守、非编码、单链小分子RNA，长度为21～23 个核苷酸，广泛存在于真核生物中。miRNA 存在多种形式，在RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下转录生成最原始的初始微小RNA（primiRNA），其长度为300～1000 个碱基，在蛋白复合物Drosha-DGCR8 的作用下进一步被加工为前体微小RNA（pre-miRNA），其长度为70～90 个碱基，pre-miRNA 经Dicer 酶酶切后，成为长度为20～23个核苷酸的成熟miRNA[7]。miRNA 在动植物中参与转录后基因表达调控，Lee 等[8]于1993 年在研究线虫异慢性基因lin-4编码过程中首次发现了miRNA，lin-4基因表达与lin-14 蛋白表达呈负相关，会使线虫发育过程的总体时间缩短。

2000 年，Reinhart 等[9]研究发现了let-7。随后多个研究小组在包括线虫、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA，并发现miRNA 在转录后基因表达调控中具有重要作用。许多miRNA在基因序列上聚集分布，这意味着机体可能会同时表达一类miRNA，导致不同或者协同的生物学效应。miRNA 转录后可抑制靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）表达，通过与靶基因的3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）相互作用进而抑制靶基因的翻译及降解。这与小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和靶基因完全匹配不同，miRNA 与靶基因之间可能会存在错配，miRNA 与靶基因结合后，可能会导致mRNA 进入P 小体进行降解[10]。

2 miRNA 与肿瘤的关系

miRNA 与肿瘤的关系十分密切。研究表明，miRNA 的异常表达是由多种肿瘤的基因畸变引起的，并通过使靶基因表达失调在肿瘤的发生、发展过程中发挥作用。因此，很多miRNA 与肿瘤的发病机制密切相关，包括细胞增殖、分化、微环境改变、凋亡、迁移和侵袭等。已有研究表明，miRNA通过调控癌基因或抑癌基因的表达，诱导肿瘤细胞增殖或凋亡。miRNA 可表现出不同的功能，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和血管生成等过程，在肿瘤的基因调控方面发挥积极作用[9]。魏雪源等[11]研究显示，miRNA 参与了高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）癌蛋白（特别是E6/E7 蛋白）所致宫颈癌细胞的迁移、侵袭过程，且miRNA 是一种重要的肿瘤调控因子，靶向调控肿瘤的一系列复杂转化。目前，已有研究发现miRNA 可以分为两大类，即致癌miRNA 和抑癌miRNA，前者在肿瘤细胞及肿瘤组织中靶向降解抑癌基因，后者则是针对癌基因进行靶向降解。丁昊等[12]研究发现，miRNA 表达失调影响前列腺肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、微环境改变、迁移和侵袭等过程。鉴于miRNA 的这些功能特性，其有望为前列腺癌的早期诊断、治疗和预后评估提供新的靶点。Inoue 和Inazawa[13]的研究分析了各种肿瘤相关miRNA 及其在肿瘤治疗中的临床应用，结果发现，肿瘤抑制微小RNA（tumor suppressor miRNA，TS-miRNA）参与多种肿瘤的发生发展过程，TS-miRNA 可同时抑制多种癌基因的表达，ds-miRNA-634 模拟物的引入显著增加了包括ESCC 细胞在内的多种肿瘤细胞对顺铂的敏感性，并且在ESCC 异种移植小鼠模型中，将dsmiRNA-634 模拟物局部注射到肿瘤周围的皮下空间，也增加了顺铂药物的抗肿瘤作用，证实了ds-miRNA-634 模拟物作为抗肿瘤药物的潜力。Menon 等[14]研究进一步说明miRNA 与肿瘤具有高度相关性，这在Kim 等[15]研究中也有体现。miRNA 是一类潜在的肿瘤标志物，在多种肿瘤的基因调控、早期筛查、诊断、治疗及预后评估等方面具有广阔的应用前景。近年来研究发现，miRNA-375 与肿瘤的发生发展关系密切。Censi等[16]研究表明，miRNA-375 可作为甲状腺髓样癌诊断和预后评估标志物。Pietrus 等[17]研究也证明了miRNA-375 与子宫内膜癌患者的预后存在相关性。Wu 等[18]研究证实miRNA-375 可通过靶向异嗜性和多嗜性逆转录病毒受体1（xenotropic and polytropic retrovirus receptor 1，XPR1），抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭，为ESCC 患者的精准治疗提供了新的潜在靶点。miRNA-375 参与调控肿瘤发生的多个环节，例如肿瘤细胞增殖、组织侵袭、淋巴结转移或远处转移等，在不同肿瘤中分别扮演了癌基因或抑癌基因的角色。

3 miRNA-375 在ESCC 中的表达

miRNA-375 是miRNA 家族的一员，主要参与细胞分化、增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程。刘阳等[19]研究表明，miRNA-375 表达水平与ESCC 患者的临床病理特征及预后均存在相关性。Hu 等[20]研究对ESCC 患者ESCC 组织中miRNA-375 表达情况进行分析，结果发现，miRNA-375 在ESCC 患者ESCC 组织中的表达显著降低，此外，与正常食管上皮Het-1A 细胞相比，食管癌EC109 细胞中miRNA-375 表达水平显著下调，表明miRNA-375 表达下调可能与食管癌的发生有关。张雪梅等[21]研究分析miRNA-375 与食管癌的相关性，结果表明，miRNA-375 在食管癌组织中的表达水平低于癌旁组织，miRNA-375 通过调控星形细胞上调基因-1（astrosyte elevated gene-1，AEG-1）的表达参与食管癌的发生、发展过程。此外，Liu 等[22]研究表明，miRNA-375 在ESCC 中作为抑癌基因，在肿瘤细胞生长、增殖及分化过程中发挥重要的负调节作用。

Li 等[23]通过定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测38 例ESCC 患者和19 例健康受试者血浆中miRNA-375 水平，结果显示，miRNA-375 低表达与ESCC 的发生有关，其可作为诊断ESCC 的潜在生物标志物。

国内外进行了大量有关miRNA-375 在ESCC组织和癌旁组织及ESCC 患者和健康人群中表达水平的研究，发现miRNA-375 在ESCC 中低表达，表明miRNA-375 在ESCC 的发生发展过程中可作为抑癌因子。Wang 等[24]进行的一项荟萃分析纳入13 项研究共1340 例ESCC 患者，结果表明，miRNA-375 低表达与ESCC 患者总生存期（overall survival，OS）较短有关，提示miRNA-375 可作为评估ESCC 患者预后的潜在生物学指标。Zhang 等[25]研究发现，与健康者相比，ESCC 患者miRNA-375 表达水平较低，而miRNA-21 和miRNA-223 均过表达，表明miRNA-375 可作为诊断ESCC 的非侵入性生物标志物。Osako 等[26]研究表明，miRNA-375在ESCC 组织中的表达明显下调，其低表达可增强ESCC 细胞的侵袭能力，并且miRNA-375 的异位表达对ESCC 细胞的迁移和侵袭具有显著的抑制作用。通过对ESCC 中miRNA-375 的表达进行研究发现，ESCC 中miRNA-375 存在异常表达调控，并且这种异常表达调控可以影响ESCC 发展的不同阶段及过程。在ESCC 发生的早期阶段，借助早期筛查方法可发现miRNA-375 低表达，这也意味着miRNA-375 是一类极其敏感的肿瘤标志物。因此，准确地检测患者血液或组织中miRNA-375 的表达水平，对ESCC 的筛查、临床治疗及预后评估具有重要意义。

4 miRNA-375 对ESCC 的靶向调控

miRNA 靶位点的寻找方法主要包括mRNA 和蛋白质水平检测。双荧光素酶基因法是目前最为常用的miRNA 靶位点鉴定方法，其基本原理如下：通过构建荧光素酶表达载体，将待鉴定的miRNA 靶基因的3'-UTR 构建到荧光素酶基因的3'-UTR 中；之后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA 的表达水平；最后检测荧光素酶的表达情况，分析转染3'-UTR 中是否含有miRNA的靶位点[27]。Ren 等[28]对食管癌与人表皮生长因子受体2（ human epidermal growth factor receptor 2，HER2，也称ERBB2）的相关性进行研究，结果表明，miRNA-375 过表达会抑制食管癌细胞的增殖和侵袭，ERBB2是miRNA-375 的潜在靶基因，参与ERBB2/血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）信号通路的调控。该研究证实miRNA-375 是肿瘤抑制因子，其通过与靶基因的3'-UTR 结合，影响ERBB2/VEGFA 信号通路，直接抑制ERBB2 的表达，进而调控ESCC 组织中VEGFA 的表达水平。miRNA-375 的发现有助于为ESCC 提供新的研究方向及治疗靶点。Luo等[29]研究纳入44 例ESCC 患者的组织标本，采用qRT-PCR 和蛋白质印迹法两种技术测定circ_0000654、E2F 转录因子3（E2F transcription factor 3，E2F3）和miRNA-375 表达水平，结果发现，miRNA-375 与circ_0000654、E2F3 表达水平均呈负相关，miRNA-375 过表达会导致circ_0000654 耗竭，促使细胞凋亡，抑制体外肿瘤细胞增殖和糖酵解等过程，从而抑制肿瘤生长。一项关于miRNA-375 在食管癌中作用机制的研究显示，miRNA-375是ESCC 的抑癌因子，其可通过下调直接靶标异黏蛋白（metadherin，MTDH）的表达来抑制肿瘤细胞的生长和浸润，调控miRNA-375/MTDH 信号通路可作为临床治疗ESCC 的潜在方法[20]。金立等[30]选取两种人ESCC 细胞（kyse-70、kyse-30），通过一系列体外细胞功能学实验，检测miRNA-375、矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）对ESCC 细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及miRNA-375 对SHOX2 的靶向调控作用，结果表明，miRNA-375 作为抑癌因子，能有效抑制ESCC 细胞生长和浸润；SHOX2可能是癌基因，促进ESCC 细胞增殖和侵袭；miRNA-375 与SHOX2 的表达呈负相关，miRNA-375 可靶向负调控SHOX2 的表达，对ESCC 细胞的增殖和侵袭具有重要调控作用，Yi等[31]研究也证实了这一观点。另有研究发现，miRNA-375/基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）13 信号通路在ESCC 细胞侵袭过程中具有关键作用[26]。He 等[32]通过分离转染后的人脐带间充质干细胞来源的外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cell derived exosome，hUCMSC-exo），并将其与ESCC 细胞共培养，检测hUCMSC-exo 递送的miRNA-375 对ESCC 发展的影响，结果显示，在ESCC 中，miRNA-375 表达降低，而ENAH 蛋白表达升高，ENAH是miRNA-375的靶基因，通过上调miRNA-375 的表达或降低ENAH 的表达来抑制ESCC 细胞增殖、侵袭、迁移并促进细胞凋亡，进而抑制肿瘤生长。张雪梅等[21]研究发现，miRNA-375 在ESCC 组织中的表达低于癌旁组织，可能与miRNA-375 调控AEG-1 的机制有关。研究表明，胰岛素样生长因子1 受体（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）是miRNA-375 的靶基因，miRNA-375 可以与IGF1R的3'-UTR 相互作用，进而抑制ESCC 细胞增殖[32]。这些研究进一步证实了miRNA-375 在ESCC 发生、发展、早期筛查、细胞周期、分化、增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程中有关键作用，准确快速地预测miRNA 靶基因对于研究miRNA-375 的功能，并分析miRNA-375 参与的靶向调控过程具有十分重要的意义。

5 miRNA-375 有望用于ESCC 的诊断和治疗

很多研究已经证实miRNA-375 与ESCC 具有密切联系，miRNA-375 通过调控靶基因的表达，参与ESCC 细胞的分化、增殖、迁移和侵袭等过程。一项荟萃分析显示，miRNA-375 表达下调与ESCC患者OS 缩短有关，其在ESCC 患者中具有高度特异性，可能是诊断ESCC 的潜在生物标志物[33]。Jamali 等[34]对食管癌生物标志物进行研究，结果发现，miRNA-375 与ESCC 的发生和发展密切相关，可作为ESCC 诊断和治疗的生物标志物。Sun 等[35]通过酶联免疫吸附试验和qRT-PCR 检测125 例ESCC 患者和125 例健康者血浆中肿瘤相关抗原自身抗体（autoantibody against tumor-associated antigen，TAAb）和miRNA 表达情况，结果显示，采用TAAb 和miRNA 联合诊断ESCC 具有很大优势，特别是对于早期ESCC 的诊断；miRNA-375 在ESCC中不仅作为肿瘤抑制因子来抑制肿瘤的发展与侵袭，也是ESCC 诊断及治疗的潜在标志物，为临床治疗ESCC 患者提供新的方法。

6 miRNA-375 对ESCC 患者预后的影响

食管癌是世界性难题，患者的5 年生存率依旧很低。miRNA-375 表达情况与ESCC 患者的预后密切相关。Fang 等[36]的荟萃分析结果显示，miRNA-375 高表达与ESCC 患者较长的OS 有关，也就是说miRNA-375 高表达与ESCC 的良好预后有关。Wu 等[37]研究检测ESCC 患者的血清miRNA-375 水平，结果显示，血清miRNA-375 低表达与ESCC 患者生存率较低有关，表明miRNA-375 异常表达直接影响ESCC 患者的预后，是ESCC 患者潜在的预后标志物。Isozaki 等[38]研究表明，miRNA-21 高表达和miRNA-375 低表达ESCC 患者的预后明显更差，miRNA-21、miRNA-375 是评价ESCC 患者预后的可靠生物标志物。另外一项研究发现，miRNA-375 低表达与淋巴浸润有关，且与ESCC 患者的不良预后有关[19]。Gao 等[39]荟萃分析结果显示，食管癌组织中miRNA-21、miRNA-133a、miRNA-133b、miRNA-138、miRNA-203、miRNA-375、miRNA-655 表达水平以及血液中miRNA-21 和miRNA-223 表达水平对于食管癌具有重要的预后预测价值，miRNA-21 高表达和miRNA-375 低表达食管癌患者的OS 明显较短。刘阳等[19]研究表明，miRNA-375 异常表达与ESCC 患者的临床病理特征及预后均有关。Li 等[23]研究显示，miRNA-21、miRNA-375 表达情况与ESCC 患者的预后有关。miRNA-375 作为miRNA 家族中的重要一员，已被多项研究证实参与ESCC 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程，miRNA-375 有望成为ESCC 诊断及治疗的新型靶点，同时也是评估患者预后的重要指标。

7 小结与展望

综上所述，ESCC 患者的5 年生存率仍不理想，miRNA-375 作为抑癌基因，在ESCC 细胞的增殖、分化、迁移、侵袭等过程中发挥重要作用，不仅可用于ESCC 的筛查，也可用于ESCC 的诊断、疗效评估和预后判断。ESCC 筛查的主要目的是检测食管鳞状异型增生和早期ESCC，以达到治愈的目的。早期ESCC 能够通过手术治疗，患者的5 年生存率可达80%～90%[40]，因此，早诊断、早治疗有助于控制ESCC 的进展和转移。miRNA-375 在肿瘤中扮演极其重要的角色，有望为肿瘤的癌前诊断、临床治疗及预后评估提供更加强有力的证据，为肿瘤患者带来更大的益处。但目前有关miRNA-375 在ESCC 中调控机制的研究较少，需要更多研究进一步证实。