胰岛素增敏剂罗格列酮升高血液中镍纹样蛋白水平

徐 飞，陈瑾，李志勇

（1.海军军医大学药学系药理教研室, 上海200433；2.海军军医大学第一附属医院内分泌科, 上海200082）

METRNL（Metrn-like）蛋白是近年来发现和证实的新的分泌蛋白[1-2]，其与METRN 构成了一个两蛋白的新蛋白家族。虽然最初的研究表明，该家族蛋白均可促进神经细胞轴突的生长[2-4]，但两者表达差异很大，METRN 在中枢神经系统中高特异性表达，而METRNL 则在全身较为广泛地表达，提示其可能具有更广泛的生理功能[1-2,5-6]。

最近的研究发现，METRNL 对代谢具有重要的调节作用。其在脂肪组织中表达较高，特别是皮下脂肪，被认为是一种新的脂肪因子[1]。研究发现，该蛋白可以调节脂肪细胞的分化，脂肪细胞中METRNL 过表达可提高全身胰岛素敏感性，减少脂肪炎症扩大脂肪细胞的体积等[7]。也有研究发现，METRNL 可以在运动后由肌肉组织增加分泌，促进脂肪组织棕色化，从而提高代谢率，减轻体重和改善胰岛素敏感性[8]。这些研究提示，METRNL可能与提高胰岛素敏感性相关。

噻唑烷二酮类药物，如罗格列酮，可以通过激动PPARγ 受体，提高胰岛素增敏性，被称为胰岛素增敏剂。但是这类药物与METRNL 蛋白之间的关系，至今尚不清楚。我们前期的研究发现，白色脂肪组织中METRNL 过表达可以提高PPARγ 的表达，促进脂肪重构，降低白色脂肪炎症，但是激动PPARγ 对METRNL 表达的影响尚未有报道。

本研究拟通过高脂饮食（HFD）诱导的胰岛素抵抗小鼠模型，检测血液METRNL 的浓度变化；通过给予胰岛素增敏剂罗格列酮治疗，构建胰岛素增敏动物模型，检测血液中METRNL 的水平变化，从而明确激动PPARγ 对血液METRNL 水平影响，通过实时定量PCR 检测不同组织中METRNL 的表达，明确PPARγ 通过何种组织调控METRNL 的表达与血液浓度。

1 材料和方法

1.1 动物处理

12 周龄的雄性C57BL/6 小鼠与小鼠饲料，均购自上海斯莱克实验动物有限公司。为检测胰岛素抵抗对METRNL 表达的影响，分两组小鼠，每组8 只，分别给予正常饮食（NCD）和HFD，均饲养4 个月；为了检测胰岛素增敏对于METRNL 表达的影响，分两组小鼠，每组8 只，两组均先HFD 饲养3 个月，而后实验组的饲料中加入药物罗格列酮（胰岛素增敏组），剂量为10 mg/kg·d，治疗1 个月，对照组继续HFD 饲养1 个月。

1.2 糖耐量实验

小鼠禁食18 h，腹腔注射30%葡萄糖溶液（2 g/kg），分别在0、30、60、90、120 min 取尾静脉血，采用强生血糖仪（OneTouch Ultra）检测小鼠血糖水平。

1.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）

戊巴比妥钠麻醉小鼠后（80 mg/kg），心脏取血收集血液，室温静置2 h，3 000 r/min 离心20 min，取上清液。采用小鼠METRNL ELISA 试剂盒（购自美国R&D biosystem 公司）检测血清中METRNL浓度。操作步骤参照试剂盒说明书。

1.4 荧光实时定量PCR 实验

取小鼠附睾周围白色脂肪、肩胛骨间棕色脂肪、肝脏、腓肠肌、脑组织、肾脏、脾脏组织，采用TRIzol 试剂（购自美国Invitrogen 公司），按照说明书抽提组织总RNA，用RT-PCR 逆转录试剂盒（购自中国TARARA 公司）逆转录为cDNA。1 μg 的cDNA 用于检测METRNL 的表达，GAPDH 作为内参。采 用2-ΔΔCt法 与SYBR® Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）试剂，反应条件为，95 ℃，5 min, 1 个循环；95 ℃, 15 s，60 ℃，30 s，72 ℃，30 s，40 个循环。相关引物序列见表1。

表1 相关引物序列

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 胰岛素增敏剂罗格列酮治疗改善了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗

对HFD 3 个月的小鼠采用罗格列酮治疗1 个月后，葡萄糖耐量实验检测其糖耐量情况如图1 所示，罗格列酮治疗组给予葡萄糖后30、60、90、120 min 的血糖浓度均明显低于单纯HFD 组（P＜0.01），说明罗格列酮治疗明显改善了小鼠的糖耐量，提高了机体胰岛素敏感性。

图1 罗格列酮对全身葡萄糖耐量的影响

2.2 胰岛素增敏剂罗格列酮治疗升高了胰岛素抵抗小鼠血液中METRNL 的水平

取正常对照组、HFD 组、HFD 罗格列酮治疗组小鼠的血清，ELISA 检测METRNL 的水平，结果如图2 所示，罗格列酮组血清中METRNL 的浓度为（6 632±358） pg/ml，是单纯HFD 组（4 271±310） pg/ml 的1.6 倍（P＜0.05）。

图2 罗格列酮对血清METRNL 水平的影响

2.3 胰岛素增敏剂罗格列酮治疗增加棕色脂肪组织和肾脏METRNL 的表达

实时荧光定量PCR 检测肌肉、肝脏、白色脂肪、棕色脂肪、脑、脾脏、肾脏等组织中METRNL的表达，结果如图3 所示，与单纯HFD 组相比，罗格列酮治疗组棕色脂肪组织METRNL 表达升高1.6 倍，肾脏组织METRNL 表达升高1.3 倍。

图3 罗格列酮对各组织METRNL 表达影响

2.4 罗格列酮治疗促进了棕色脂肪代谢与棕色脂肪标记蛋白的表达

实时荧光定量PCR 检测棕色脂肪组织代谢与棕色脂肪标记蛋白等mRNA 表达情况，结果如图4所示，与单纯HFD 组相比，罗格列酮治疗组ERRα、UCP-1、clec10a、Mrc-1、Lipe、LPL、FABP4、CD36、PNPLA2 等因子表达显著升高。

图4 罗格列酮治疗促进了棕色脂肪中代谢与棕色脂肪标记蛋白的表达

3 讨论

本研究通过HFD 诱导胰岛素抵抗的肥胖小鼠，发现HFD 可以导致METRNL 血液水平升高。对肥胖小鼠不同组织METRNL 表达的检测显示，脂肪组织METRNL 表达显著升高。HFD 诱导的胰岛素抵抗小鼠，给予胰岛素增敏剂罗格列酮治疗后，小鼠糖耐量改善，同时，血清METRNL 的浓度也升高。这些结果说明，METRNL 并非胰岛素敏感性的特异性指标，脂肪可能是使血液METRNL水平改变的主要组织之一。

Li 等研究发现，肥胖小鼠的脂肪组织METRNL表达增加[7]。本研究也表明，METRNL 的血液浓度在高脂诱导肥胖后升高。Löffler 等研究发现，METRNL 与脂肪细胞的肥大相关，而脂肪细胞肥大被认为与PPARγ 活性的降低相关，是胰岛素抵抗的重要标志之一，进而认为METRNL 是机体胰岛素抵抗的标志[9]。然而，在本研究中，胰岛素增敏剂罗格列酮治疗后小鼠胰岛素敏感性提高，同时METRNL 表达也显著升高，可见METRNL 血液浓度的升高并不能代表胰岛素抵抗的增加。

罗格列酮可以显著提高胰岛素的敏感性，故也称为胰岛素增敏剂。本研究表明，其可以显著提高METRNL 的表达，而METRNL 又具有促进白色脂肪棕色化和提高胰岛素敏感性的作用，所以METRNL 可能参与介导了罗格列酮的胰岛素增敏作用。

我们前期的研究表明，增加白色脂肪表达可以提高血液中METRNL 的水平。本研究发现，罗格列酮未促进高脂条件下白色脂肪METRNL 的表达，在检测的7 种组织中，罗格列酮显著提高了棕色脂肪和肾脏METRNL 的表达，但是对脾脏、肝脏、肌肉、白色脂肪、脑组织METRNL 的表达没有影响，说明罗格列酮可能主要通过棕色脂肪和肾脏提高血液METRNL 浓度。此外，进一步实验发现，罗格列酮促进了棕色脂肪中代谢和棕色脂肪标记蛋白的表达，这与以往的研究结果一致[10]，既往研究表明，METRNL 可促进白色脂肪棕色化，提示罗格列酮促进棕色脂肪代谢的作用可能有METRNL蛋白参与。

本研究发现了胰岛素增敏剂罗格利酮治疗可能通过提高棕色脂肪和肾组织的METRNL 表达来升高血清METRNL 水平，提示METRNL 可能参与了罗格列酮对糖尿病的治疗过程。