一种有效采集核酸气溶胶的方法

孙世雄，焉 鑫，孙翔翔，孙明军，高玉斌，孙 静，张培培，王毓秀，孙淑芳

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266114）

经过新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染和非洲猪瘟疫情，不管是医院、疾病预防控制部门，还是规模养殖场、动物疫病预防控制部门，其核酸检测实验室的数量都快速增长[1]。作为核酸检测实验室的必备技术，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）具有极高的灵敏度。这也意味着，微量的核酸污染即可导致假阳性结果出现[2]。核酸气溶胶便是常见的污染之一，也是核酸检测实验室必须预防和控制的一个问题。因此，实验室在开展核酸检测之前，首先要做的便是判断室内是否存在核酸气溶胶污染，而判断结果的准确性取决于核酸气溶胶采样方法的有效性。

对于核酸气溶胶的采样，实验室常用空气沉降法[3]。将装有超纯水的离心管开盖置于实验室不同区域，静置一段时间后，不经核酸提取，直接加入扩增反应体系进行检测[4-5]。该方法是在静止状态下，用水被动溶解核酸气溶胶，其最大的缺陷在于偶然性，只有当环境中的核酸气溶胶扩散并接触到离心管内的超纯水时，才能被采集。为此，本试验引入气体采样泵和过滤吸头，变静态采样为动态采样，变被动溶入为主动吸附，能够显著提高目标核酸的检出率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备 喷雾瓶（广州名创优品有限责任公司，50 mL）、气体采样泵（河南省保时安电子科技有限公司，吸气流量500 mL/min）、生物安全柜（力康生物医疗科技控股有限公司，HFsafe-1200LC）、 荧光定量PCR 仪（Thermo Fisher Scientific，QuantStudio 5）。

1.1.2 试剂耗材 pBR322 质粒DNA（上海生工生物工程股份有限公司，质量浓度为0.5 mg/mL，由E. coli菌株抽提得到）、布鲁氏菌核酸（羊种3型，质量浓度为15.7 ng/μL，由中国动物卫生与流行病学中心国家动物布鲁氏菌病专业实验室保存）、超纯水（取自德国默克密理博Milli-Q Integral 3 超纯水机）、过滤吸头（BBI 生命科学有限公司，规格为200 μL，灭菌，无DNA 酶、RNA 酶，盒装）、一次性乳胶管（河南省保时安电子科技有限公司，内径3 mm，长10 cm）、离心管（BBI 生命科学有限公司，1.5 mL，灭菌，无DNA 酶、RNA 酶）、八连管（德国Greiner 公司，规格为200 μL）、2×酶预混液（湖南艾科瑞生物工程有限公司，ProTaqHS Premix Probe qPCR Kit）、灭菌双蒸水（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 模拟核酸气溶胶污染

选取一间体积为23 m³的房间，靠墙放置一张桌子。房间内无定向气流，每天开窗通风。吸取100 μL pBR322 质粒DNA，加入盛有50 mL 超纯水的喷雾瓶内，混匀后均匀喷洒于房间内，静置30 min。

1.3 样品采集

在房间内选取6 个采样点，采样点1、2 和3均匀分布于桌面，采样点4、5 和6 均匀分布于地面。在喷洒后0 d（即喷洒当天）、5 d 时，对每个点同时用对照组和试验组方法采样。

对照组：取6 个1.5 mL 离心管，均加入500 µL超纯水，然后开口静置于房间内30 min，以管内溶液为核酸检测模板。

试验组：取6 个气体采样泵，在进气端连接一次性乳胶管。过滤吸头剪半后，将带滤芯的一半插入乳胶管的另一端，确保连接处不漏气（图1）。打开采样泵，置于房间内30 min 后，将过滤吸头取下放入盛有500 µL 超纯水的离心管中，振荡、离心后，以管内溶液为核酸检测模板。

图1 采样装置示意图

1.4 样品实时荧光定量PCR 检测

根据pBR322质粒DNA序列，设计上游引物（pBR322-F：5'-TCCAACCCGGTAAGACACGA-3'）、下游引物（pBR322-R：5'-AGAACTCTGTAGCACCGCCT-3'）和探针（pBR322-P：5'-FAM-TATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTA-BHQ1-3'），交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以灭菌双蒸水为阴性对照，pBR322质粒DNA（10 ng/μL）为阳性对照，进行实时荧光定量PCR检测。反应体系25.0 μL：2×酶预混液10.0 μL、pBR322-F（10 µmol/L）0.6 μL、pBR322-R（10 µmol/L）0.6 μL、pBR322-P（10 µmol/L）0.6 μL、模板5.0 μL、灭菌双蒸水8.2 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火35 s（收集荧光），40 个循环。

1.5 日常监测应用

1.5.1 核酸气溶胶采样 选取一间布鲁氏菌分子生物学实验室，在桌面设置3 个采样点，对每个采样点同时用上述两种方法进行布鲁氏菌核酸气溶胶采样。每周采样检测1 次，直至出现阳性结果。

1.5.2 核酸气溶胶检测 布鲁氏菌核酸实时荧光定量PCR 检测所用引物、探针参照动物布鲁氏菌实时荧光PCR 检测方法（T/CVMA 20—2020）合成，分别为上游引物（Bru-F：5'-CGCTCGCGCGGTGGAT-3'）、下游引物（Bru-R：5'-CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC-3'）和 探 针（Bru-P：5'-FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-BHQ1-3'），交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应体系25.0 μL：2×酶预混液10.0 μL、Bru-F（10 µmol/L）0.6 μL、Bru-R（10 µmol/L）0.6 μL、Bru-P（10 µmol/L）0.6 μL、DNA 模板5.0 μL、灭菌双蒸水8.2 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火35 s（收集荧光），40 个循环。以无菌无核酸酶水为阴性对照，布鲁氏菌核酸为阳性对照。

2 结果

2.1 pBR322 质粒DNA 实时荧光定量PCR 检测

结果（图2）显示，阳性对照Ct 值为7.734，且有特征性扩增曲线，阴性对照无Ct 值且无特征性扩增曲线，试验成立。喷洒后0 d 采样检测时，试验组在5 个采样点的扩增曲线起峰均早于对照组；喷洒后5 d 采样检测时，试验组在全部6 个采样点的扩增曲线起峰均早于对照组。

图2 pBR322 质粒实时荧光定量PCR 扩增结果

结果（表1）显示：喷洒后0 d 采样检测时，试验组6 个采样点的Ct 平均值为22.732，低于对照组的25.027；喷洒后5 d 采样检测时，对照组只有3 个采样点能检测到Ct 值，且皆高于相应试验组数值。

表1 pBR322 质粒实时荧光定量PCR 检测Ct 值

2.2 日常监测结果

日常监测中，共连续采样6 次。前5 次采样后，对照组和试验组皆未检测到布鲁氏菌核酸，说明在这段时间内该实验室不存在布鲁氏菌核酸气溶胶污染。第6 次采样后，对照组在3 个采样点皆未检测到布鲁氏菌核酸，而试验组皆可检测到，且Ct 值均为34（图3、表2）。结果表明，在第6 周时该实验室已受到布鲁氏菌核酸气溶胶污染，应该暂停相关试验活动，及时清除核酸污染。

表2 布鲁氏菌核酸实时荧光定量PCR 检测Ct 值

图3 布鲁氏菌核酸气溶胶实时荧光定量PCR 扩增结果

3 讨论

本研究创新采用气体采样泵与过滤吸头相结合的方式，发明了一个有效采集核酸气溶胶的装置。该装置具有以下特点：一是高效，试验组方法所用气体采样泵的吸气流量为500 mL/min，在30 min内有1.5 L 室内空气通过吸头滤芯，核酸气溶胶在滤芯部位富集；二是轻巧便携，采样泵作为装置的主体，仅有手掌大小，使用时连接吸头即可；三是可防交叉污染，采样泵通过一次性塑料管与一次性过滤吸头连接，一用一换，能够有效防止不同采样过程之间交叉污染。

当空间内核酸气溶胶的浓度较高时，试验组和对照组Ct 值均小于30，且都出现了特征性扩增曲线。此时，使用两种方法均能检测到核酸气溶胶污染的存在。但是试验组在6 个采样点的平均Ct值较小。结果提示，使用试验组方法采集到了更多的核酸气溶胶。当空间内核酸气溶胶浓度较低时，对照组仅在一半采样点检测到Ct 值，且出现特征性扩增曲线。而试验组在全部采样点均检测到Ct值，且出现特征性扩增曲线。结果提示，使用试验组方法采集到了更多的核酸气溶胶，且在污染较轻的情况下优势更明显，能够避免假阴性结果出现。

采样的科学性对于环境监测至关重要。如果不能有效采集样本，得到的可能会是“假阴性”结果[6-7]。例如，本试验对照组在喷洒后5 d 采样时，一半采样点的检测结果为阴性，表明使用对照组方法在这3 个点上未能采集到目标核酸。优化样本采集，除了开发应用新技术，还可以采取以下措施：一是延长装水离心管在空间内的放置时间，二是在空间内设置多个采样点。若任一采样点核酸检测结果为阳性，均应暂停实验室运行，并采取相应措施加强实验室清洁、消毒和除核酸，直至环境监测结果全部合格[8]。

在判断实验室是否存在核酸气溶胶污染的问题上，采样方法各异。周志图[9]在其发明专利中，为验证所发明的核酸气溶胶清除剂的效果，在实验室中轴线上、中、下3 个方位，分别放置滤膜，用于采集并回收空气中的核酸气溶胶。在对洁净工作台或生物安全柜进行空气采样时，马祥等[10]建议打开风机，将用水浸润过的多层纱布置于排风口，在5～10 min 后洗脱纱布上捕获的核酸。受此启发，可以将用水润湿的纱布置于实验室排风口处，用于对整个实验室环境进行监测。北京大学第三医院的袁晓宁等[11]在评价武汉市某定点医院SARSCoV-2 污染情况时，采用北京鼎蓝科技有限公司生产的便携式生物气溶胶采样器WA-15 对病区环境中可能存在的病毒进行采样，效果显著。该设备是一款旋风式生物气溶胶采样器，可与冻存管结合使用，将空气中的颗粒物直接采集到液体中。它不仅可以采集细菌、真菌、病毒等微生物，还可以采集悬浮在气体介质中的核酸气溶胶[12]。类似的气溶胶采集仪器价格昂贵，难以在基层实验室推广使用。除上述直接对空气进行采样的方法，罗冰科等[13]在应用核酸清洁剂清除法医DNA 实验室核酸污染的研究中，参照干湿两步法，采用棉签擦拭试验台面、移液器、金属浴、离心机的表面，间接采集实验室气溶胶，据此验证清洁剂对气溶胶的去除效果。与上述方法相比，本文发明的采样装置简单易用，变被动溶入为主动吸附，直接采集气溶胶，能够提高目标核酸的检出率。