抑制泛素特异性蛋白酶7改善血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

陈梦雅 谢赛阳 邓伟

【摘要】目的 探究泛素特異性蛋白酶7（USP7）抑制剂FT671在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的H9C2细胞肥大中的作用和潜在机制。方法 将H9C2细胞随机分为四组：对照组、FT671组、AngⅡ组、FT671+AngⅡ组。利用α-actinin细胞免疫荧光染色检测心肌细胞表面积；western blot检测心房钠尿肽（ANP）、脑钠肽（BNP），B细胞淋巴瘤2（BCL-2）、B细胞淋巴瘤2相关蛋白X（Bax）、白细胞介素-6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）以及NADPH氧化酶4（Nox4）的蛋白表达水平；RT-PCR检测 ANP、BNP、肌球蛋白重链（β-MHC）、IL-6、MCP-1、TNF-α的mRNA表达；TUNEL染色检测细胞凋亡情况，细胞计数试剂盒8（CCK8）实验检测各组细胞活力，活性氧（ROS）染色检测细胞内氧化损伤水平。结果 与对照组相比，AngⅡ组USP7蛋白表达明显增加，而使用FT671后，USP7表达明显被抑制。与AngⅡ组相比，FT671+AngⅡ组心肌细胞面积减小；ANP、BNP、Bax的蛋白表达减少，ANP、BNP、β-MHC、Bax、IL-6、MCP-1以及TNF-α的mRNA表达减少；BCL-2的蛋白和mRNA表达均增加。与AngⅡ组相比，FT671+AngⅡ组TUNEL阳性细胞明显减少，心肌细胞活力增强， ROS生成减少，Nox4、NLRP3蛋白表达减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 FT671通过抑制Nox4/ROS/NLRP3炎性通路减轻AngⅡ诱导的心肌细胞中的氧化应激和炎性反应，从而减轻心肌细胞肥大。

【关键词】泛素特异性蛋白酶7；血管紧张素Ⅱ；FT671；心肌肥厚；氧化应激

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.02.000

Inhibition of Ubiquitin-Specific Protease 7 Improves AngiotensinⅡ-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy

CHEN Mengya，XIE Saiyang，DENG Wei

（Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Metabolic and Chronic Diseases，Wuhan 430060，Hubei，China）

【Abstract】Objective To investigate the effect and mechanism of ubiquitin-specific protease 7（USP7） inhibitor FT671 in cardiomyocyte hypertrophy induced by angiotensinⅡ（AngⅡ）. Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into four groups： control group，FT671 group，AngⅡ group，FT671+AngⅡ group. The surface area of cardiomyocytes was detected by immunofluorescence staining of α-actinin. The protein expression of atrial natriuretic peptide （ANP），brain natriuretic peptide （BNP），B-cell lymphoma-2 （BCL-2），B-cell lymphoma-2-associated X protein （Bax），interleukin-6 （IL-6），monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1），tumor necrosis factor-α （TNF-α），nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3） and reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 （Nox4） were detected by western blot. The mRNA levels of ANP，BNP，β-myosin heavy chain （β-MHC），IL-6，MCP-1，TNF-α were detected by Real-Time PCR. TUNEL staining was used to evaluate cell apoptosis. Cell Counting Kit-8（CCK8） was used to detect cell viability. The fluorescent probe 2'，7'-dichlorofluorescein diacetate （DCFH-DA） was used to measure intracellular reactive oxygen species （ROS） formation. Results There was a significant increase in USP7 protein expression in the AngⅡ group，which was evidently inhibited by the USP7 inhibitor FT671. Compared with AngⅡ group，cardiomyocyte surface area was significantly reduced in FT671+AngⅡ group; the protein expression of ANP，BNP and Bax，as well as mRNA level of ANP，BNP，β-MHC，Bax，IL-6，MCP-1，TNF-α，were decreased in FT671+AngⅡ group. In addition，the protein expression and mRNA level of BCL-2 were increased in FT671+AngⅡ group. Additionally，compared with AngⅡ group，TUNEL positive cells was significantly reduced，cell viability was improved and ROS generation was inhibited in FT671+AngⅡ group. Further studies showed the protein expression of NLRP3 and Nox4 was decreased after FT671 treatment in AngⅡ induced cardiomyocyte hypertrophy. Conclusion The USP7 inhibitor FT671 attenuated oxidative stress and inflammatory response in AngⅡ-induced cardiomyocyte by inhibiting the Nox4/ROS/NLRP3 inflammatory pathway，thereby reducing cardiomyocyte hypertrophy.

【Keywords】Ubiquitin-specific protease 7；AngiotensinⅡ；FT671；Hypertrophy；Oxidative stress

心力衰竭是各种心脏疾病发展的终末阶段，以心肌肥厚和纤维化为特征的心肌重构已被确定为心力衰竭病程进展中的决定性因素[1]。生理性心肌肥厚在刺激消失后可以逆转，而心肌梗死、高血压等长期慢性刺激导致的病理性心肌肥厚往往会导致心肌重构，产生不良后果，如心律失常、心力衰竭等[2]。心肌肥厚的发生发展机制比较复杂，至今尚未完全阐明。因此，探讨心肌肥厚的发生发展机制，从而寻找更有效的作用靶点，抑制甚至逆转心肌重构的发生是针对心力衰竭的重要策略。

泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，通过对底物蛋白的泛素化降解，参与包括细胞周期调节、免疫反应、细胞受体功能及肿瘤生长等在内的多种细胞活动[3]。去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）家族可将泛素分子从泛素化标记的蛋白质或者前体蛋白上水解下来，起到去泛素化的作用，对蛋白降解进行反向调节[4-5]。既往研究[6-8]显示，DUB在心肌肥厚、心肌梗死、心房颤动等心血管疾病中起着至关重要的作用。泛素特异性蛋白酶7（ubiquitin-specific protease 7，USP7）是第一个被发现的DUB，主要位于细胞核中，参与细胞增殖、DNA损伤反应、肿瘤发生、炎症和细胞凋亡等过程[9-10]，在神经退行性疾病和癌症中被广泛研究，USP7的抑制剂也常作为抗肿瘤药物被广泛研究[11-12]，但是在心血管系统疾病中研究较少。最近研究[13]发现USP7在心肌细胞缺氧条件下的表达显著增加，可能参与心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤过程。然而，关于USP7在心肌肥厚中的作用和分子机制知之甚少。在本研究中，应用USP7特异性抑制剂FT671干预血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）诱导的H9C2心肌细胞肥大，探讨USP7在心肌细胞病理性肥大中的作用和作用机制。

1  材料和方法

1.1  实验材料

试剂：H9C2心肌细胞购自中国科学院细胞库（上海，中国）。FT671（HY-107985） 购自美国MedChemexpress（MCE）公司，AngⅡ（美国Sig-maAldrich公司），胎牛血清和F12培养液（美国Gibco公司），USP7抗体（ABclonal，A3448），α-actinin、心房钠尿肽（ANP）、脑尿钠肽（BNP），B细胞淋巴瘤2（BCL-2）、B细胞淋巴瘤2相关蛋白X（Bax）抗体（美国abcam公司），核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3），羊抗兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司），NADPH氧化酶4（Nox4）（Proteintech）。TUNEL染色试剂盒，细胞计数试剂盒8（CCK8）试剂盒，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（Beyotime Biotechnology）。Trizol（Invitrogen），反转录试剂盒（瑞士Roche公司），Radioimmunoprecipitation Assay Buffer（RIPA）裂解液（美国赛默飞世尔公司）。

仪器：凝胶电泳系统（北京六一仪器厂），凝胶电泳转移系统（BIO-RAD），聚偏二氟乙烯膜（美国Milipore），化学发光蛋白检测显影仪（美国Borad），荧光显微镜（OLYMPUS DX51），SYBRGreen I Master（瑞士Roche公司，4707516001），LightCycler480 SYBRGreen荧光定量仪（瑞士Roche公司，型号：LC480），酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，Synergy HT）。

1.2  方法

1.2.1  细胞培养与分组

使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 °C、95%O2、5%CO2培養箱中培养H9C2心肌细胞，待细胞贴壁之后长至90%密度左右，用0.25% 胰蛋白酶消化传代，待细胞长至培养皿面积的70%～80%时，进行以下实验：

将H9C2心肌细胞随机分为4组（n=6）：空白对照组，FT671（10 μmol/L）组，AngⅡ（1 μmol/L）组，FT671（10 μmol/L）+ AngⅡ（1 μmol/L）组。待细胞长至培养皿面积的70%～80%，换液之后根据分组加入生理盐水或AngⅡ和/或FT671，培养24 h之后收集细胞进行后续实验。

1.2.2  细胞免疫荧光检测细胞面积

采用细胞爬片，用4%多聚甲醛固定细胞，0.2%Triton-X-100通透细胞，10% 羊血清室温孵育60 min进行封闭。α-actinin一抗（1﹕200）4 °C 孵育过夜，绿色荧光标记的二抗（1﹕100）湿盒中37 °C 孵育60 min。滴加封片剂封片，放置10 min左右后，在荧光显微镜下观察、拍照，并使用Image J软件分析，计算各组心肌细胞肥大面积。

1.2.3  免疫印迹法western blot检测目的蛋白表达

提取各组心肌细胞蛋白，采用BCA法进行定量，制备上样蛋白，使用10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳分离蛋白，转膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，孵育一抗置于4 °C过夜。用Tris缓冲液加Tween 20液洗膜3次后，二抗室温孵育1 h，使用化学发光后成像系统进行图像采集，Image J软件对蛋白表达水平进行定量，β-tubulin作为内参蛋白。

1.2.4  实时定量PT-PCR法检测目的基因mRNA表达

按照 Trizol （Invitrogen）法提取细胞总mRNA，紫外分光光度计检测RNA含量及纯度。每个样本取2 μg总mRNA，使用Roche反转录试剂盒（20 μL反应体系）反转录，之后进行PCR扩增，以GAPDH作为内参基因，计算各组相较于对照组的相对表达量，计算公式为2-ΔΔCt（表1）。

1.2.5  TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

处理后的细胞用4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.2%Triton-X-100通透细胞，每组加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。滴加含有DAPI的封片剂封片，放置10 min左右后，在荧光显微镜下观察、拍照，并使用Image J软件分析，计算各组每个视野TUNEL阳性细胞占总细胞的比率即凋亡率。

1.2.6  CCK8检测心肌细胞活性

使用CCK8试剂盒检测细胞活性。于96 孔板中每孔加入100 μL（约4 000个细胞）H9C2细胞悬液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，待细胞贴壁后根据分组进行处理，培养24 h后每孔加入10 μL CCK8试剂，继续置于培养箱内孵育2 h。用酶标仪检测，分别于450 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值，计算细胞活性。实验结果以细胞存活率表示，细胞存活率=（实验组OD值－空白对照组OD 值）/（对照组OD 值－空白对照组OD值）× 100%。

1.2.7  ROS实验检测氧化损伤

使用荧光探针DCFH-DA测量细胞内ROS的形成。用10 μmol/L DCFH-DA處理细胞爬片并置于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清培养液洗涤三次。用倒置显微镜记录心肌细胞中ROS的荧光，并用Image J软件进行分析。

1.3  统计学处理

应用Graph Pad Prism 9.0统计学软件对数据进行统计分析，Image J软件分析条带灰度值，Adobe Illustrator软件进行图形绘制。数据采用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较采用成对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  FT671作用验证及对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大面积的影响

western blot检测显示AngⅡ刺激的心肌细胞中USP7蛋白表达明显增加，在应用USP7抑制剂FT671后，FT671组和FT671+AngⅡ组USP7表达明显减少（图1A、B）。对不同组H9C2细胞进行α-actinin免疫荧光染色后，与空白对照组比，AngⅡ组和FT671+AngⅡ组心肌细胞面积增加，而相比于AngⅡ组，应用FT671后心肌细胞面积明显减少（图1C、D），差异有统计学意义（P<0.05）。

注：A、B为western blot检测H9C2心肌细胞内USP7蛋白表达的电泳图及蛋白相对定量（n=6）；C、D为心肌细胞α-actinin免疫荧光图及荧光定量（n=3），倍数400。ns表示两组差异无统计学意义；****表示P<0.000 1。

图1 FT671作用验证及对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大面积的影响

2.2  FT671对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大分子标志物的影响

应用western blot检测各组心肌细胞ANP、BNP的蛋白表达变化，real time-PCR检测各组心肌细胞ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达变化。结果显示，AngⅡ干预组H9C2心肌细胞ANP、BNP蛋白（图2A、B、C）以及ANP、BNP、β-MHC的mRNA（图2D、E、F）的表达较对照组明显增高（P<0.05），而FT671能降低AngⅡ诱导的ANP、BNP、β-MHC的表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。

注：A、B、C为western blot检测H9C2心肌细胞内ANP、BNP蛋白表达以及蛋白定量（n=6）；D、E、F为real time-PCR检测心肌细胞ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达变化（n=6）。ns表示两组差异无统计学意义；****表示P<0.000 1，***表示P<0.001，**表示P<0.01。

图2 FT671对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大分子标志物的影响

2.3  FT671对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡指标的影响

应用western blot检测各组心肌细胞BCL-2和Bax的蛋白表达变化，结果显示，与空白对照组比，AngⅡ组心肌细胞Bax表达增加，BCL-2表达降低，而相比于AngⅡ组，FT671+AngⅡ组心肌细胞Bax下调，BCL-2表达上调（图3A、B、C），差异有统计学意义（P<0.05）。TUNEL染色显示相比于AngⅡ组，FT671组TUNEL阳性细胞数明显减少，心肌细胞凋亡率下降（图3D、E），差异具有统计学意义（P<0.05）。应用CCK8法检测各组心肌细胞活性的变化，与空白对照组相比，FT671对H9C2心肌细胞活性的影响无统计学差异（P>0.05）；而相比于AngⅡ组，FT671能明显提高AngⅡ刺激后的细胞存活率（图3F），差异具有统计学意义（P<0.05）。

注：A、B、C为western blot检测H9C2心肌细胞内Bax、BCL-2蛋白表达以及蛋白定量（n=6）；D、E为TUNEL染色检测TUNEL阳性凋亡细胞以及凋亡率（n=6），倍数200。F为CCK8法检测心肌细胞活性（n=6）。 ns表示两组差异无统计学意义；****表示P<0.0001；**表示P<0.01。

图3 FT671对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡指标的影响

2.4  FT671对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的作用机制

既往研究表明，AngⅡ促进心肌细胞内ROS生成是其诱导心肌肥大的重要机制，因此笔者检测了FT671对AngⅡ刺激的细胞内ROS生成的影响，发现 AngⅡ干预组ROS水平较对照组明显升高，FT671干预可以明显降低AngⅡ诱导的心肌细胞内ROS的产生（P<0.05）（图4A）。另外，笔者检测了炎症通路分子NLRP3[14]和ROS生成相关的关键酶Nox4[15]的蛋白表达水平。结果显示，相比于AngⅡ组，FT671可以降低心肌细胞内NLRP3和Nox4的蛋白表达水平（图4B、C、D）。real time-PCR检测显示FT671干预可以降低AngⅡ诱导的IL-6、MCP-1、TNF-α炎性因子的表达（图4E、F、G）。这些实验表明FT671通过抑制ROS介导的Nox4/NLRP3炎症通路改善AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

注：A为ROS染色检测心肌细胞内ROS含量（n=6），倍数200；B、C、D为western blot检测心肌细胞内Nox4、NLRP3蛋白表达及蛋白定量（n=6）；E、F、G为real time-PCR检测心肌细胞IL-6、MCP-1、TNF-α的mRNA表达变化（n=6）； ns表示两组差异无统计学意义；****表示P<0.000 1；***表示P<0.001；**表示P<0.01。

图4 FT671对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的作用机制

3  讨论

在本研究中，证明了USP7抑制剂FT671在调节AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中起着重要作用。本研究利用USP7抑制剂FT671从形态学和分子标志物两方面进行了验证，发现USP7在AngⅡ刺激后的心肌细胞中表达显著增加。FT671抑制USP7显著减轻了AngⅡ诱导的心肌细胞内肥大、凋亡、炎性反应和ROS的产生。机制上，FT671可能是通过抑制Nox4相关的氧化应激和NLRP3炎性小体的活化，改善心肌细胞肥大。总的来说，本研究发现USP7参与AngⅡ诱导的心肌肥大过程，并提示抑制USP7可能是治疗心肌肥厚的一种潜在新靶点。

泛素化和去泛素化过程是一个动态过程，调节特定的蛋白质-蛋白质相互作用。USP7是一种DUB，通过催化泛素分子与底物之间酰胺键的水解将泛素分子从标记蛋白上水解下来，阻止目标蛋白被降解，从而调节细胞生理过程[16]。已知USP7可以调节MDM2/p53[17-18]、磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）[19]、NLRP3[20]等靶蛋白的降解，在病毒复制、细胞信号转导、DNA损伤修复、表观遗传调控和免疫反应中发挥重要作用[21]。近年来，USP7在心血管领域的研究逐渐增多，既往研究发现，USP7在缺血再灌注损伤小鼠模型中可促进心肌细胞炎症和凋亡[13]。

本研究发现AngⅡ刺激的心肌细胞中USP7表达增加（图1），表明 USP7 可能参与AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程。AngⅡ刺激后心肌细胞表面积明显增加，肥厚标志物ANP、BNP、β-MHC表达增加，而FT671可缓解上述肥厚基因的表达（图1、2）。这表明靶向抑制USP7可能有助于减轻AngⅡ诱导的心肌肥厚。之前的研究[22-24]已经证实，凋亡，炎性反应和氧化应激在心肌梗死后心肌重构中起着关键作用。因此笔者检测并发现应用FT671后AngⅡ刺激的心肌细胞中促凋亡因子Bax的增加减少，而抗凋亡因子BCL2表达明显增加。除此之外，CCK8和TUNEL染色的结果也证明应用FT671可以改善心肌细胞的存活率，减少细胞凋亡（图3）。这些结果提示USP7参与调节AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡过程。ROS生成过多会加剧心肌细胞内的氧化损伤，推动心肌细胞损伤和凋亡进程[25]。Nox4是催化ROS生成的关键酶，下调Nox4的水平可以减少ROS的产生，减轻心肌细胞内的氧化应激水平，改善心肌肥大[26]。本研究显示FT671的使用降低了Ang Ⅱ诱导的氧化应激，这体现在其抑制ROS产生和Nox4的表达上（图4）。更进一步研究发现，FT671抑制USP7后下調了NLRP3水平，减少了炎性因子IL-6、MCP-1、TNF-α的表达（图4），这可能与NLRP3炎性小体受抑制有关系。

USP7在小鼠心肌缺血再灌注损伤过程中表达增加，抑制USP7表达可抑制氧自由基的生成和心肌细胞凋亡，减轻心肌组织损伤，改善心功能[27]。本研究证实抑制USP7可以减轻AngⅡ诱导的心肌细胞内的凋亡和炎性反应，降低ROS的生成。Liu等[20]发现USP7可以靶向并去泛素化Nox4，从而导致ROS产生增加。本研究也证实了抑制USP7可以降低AngⅡ诱导的Nox4水平。另外。有研究[28]证明USP7可以调节NLRP3炎性小体的泛素化状态。本研究也发现抑制USP7可以下调心肌细胞中NLRP3的水平。因此，USP7可能通过靶向Nox4和NLRP3蛋白发挥去泛素化作用，从而参与AngⅡ诱导的炎性反应和氧化应激过程，调节心肌肥厚和心肌重构。本研究仍存在一些局限性。目前，AngⅡ诱导USP7表達增加的具体机制尚不清楚，需要在未来进一步探索。

总之，本研究表明，在AngⅡ刺激的心肌细胞中，USP7表达增加，并且通过靶向Nox4和NLRP3的去泛素化来调节AngⅡ诱导的心肌细胞内的氧化应激和炎性反应从而参与心肌肥厚的形成，而抑制USP7或可成为治疗心肌重构中心肌肥厚的新靶点。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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收稿日期：2023-05-04