小麦miRNA靶基因的体外实验验证

房春豪 陈志浩 王开 汪晓璐 徐文竞 祁广 马朋涛 韩冉 刘成

关键词：小麦miRNA;靶基因；Tae-miR9666a; GFP；本氏烟草

miRNA是一类内源非编码单链小RNA，广泛存在于动植物体内，在转录和转录后水平实现对特定基因表达的调控，从而参与细胞分化、生长和发育等多种生物学调控。在植物中，miRNA在RNA聚合酶Ⅱ作用下转录形成较长的pri-miRNA，随后在结合蛋白DAWDLE（DDL）、锌指蛋白（SE）等作用下，形成双链miRNA（ miRNA：miRNA*）；双链miRNA在miRNA甲基转移酶HENI的作用下进行甲基化修饰，并被转运蛋白HASTY运送到细胞质中：成熟的miRNA通过与Argonaute（AGO）蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）来发挥作用。miRBase数据库（Release 22.1，March2018，http：//www.mirbase.org）中登记注册的重要作物miRNA共计2863条，其中小麦成熟的miR-NA共有125条，由122个前体编码。

miRNA控制靶基因的方式主要是通过切割靶基因或者是抑制靶基因表达。miRNA切割目标基因是使与其互补配对区域的某两个核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂，而磷酸二酯键的断裂主要由具有核酸内切酶活性的AG01蛋白介导。识别miRNA的靶基因并判断两者之间相互作用的机制，有利于分析研究miRNA及其靶基因的功能。

前期我们通过sRNA测序筛选到一条新miR-NA，将其命名为Tae-miR9666a。保守性分析发现该miRNA为小麦所特有的，仅在小麦籽粒中表达，且表达量随籽粒发育逐渐升高。本研究团队利用大麦条斑花叶病毒对Tae-miR9666a的功能进行研究，发现过表达此miRNA可使小麦籽粒大小發生变化。生物信息预测及降解组测序发现Tae-miR9666a的靶基因为Rpbl，该基因编码RNA聚合酶Ⅱ的大亚基。

本研究利用体外实验，通过合成Tae-miR9666a前体及前体突变体，构建含有GFP标记的Rpbl过表达载体，并共转化烟草，通过观察GFP的荧光亮度来判断靶基因的切割情况，以验证Tae-miR9666a与靶基因Rpbl的相互作用。

1材料与方法

1.1实验材料

小麦品种中国春（Chinese Spring，CS），表达载体pBI221-GFP、pAMBI1300，均由山东省农业科学院作物研究所小麦细胞遗传学实验室保存。

1.2实验方法

1.2.1Tae-miR9666a靶基因切割位点的预测利用在线软件psRNA Target（http：//plantgrn. no-ble.org/psRNATarget/）对Tae-miR9666a的革巴基因切割位点进行预测。

1.2.2pre-miR9666和pre-TmiR9666的合成miR9666的前体序列pre-miR9666及其改造后的pre-TmiR9666序列见图1，其中红色画线部分碱基为替换碱基，以使其形成的miRNA无法切割靶基因。这两条序列由北京擎科生物科技股份有限公司青岛分公司合成到pAMBI1300载体上，得到pAMBI1300-miR9666；阳pAMBI1300-TmiR9666.

1.2.3DNA提取及基因克隆利用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取中国春小麦基因组DNA，提取方法参照文献。利用小麦基因组网站（ht-tps：//www. wheatgenome. org/Tools-and-Resources/Wheat-Transcript-Resources）对前期预测到的Tae-miR9666a的靶基因Rpbl的部分序列进行克隆，方法参照文献，引物序列见表1，将鉴定为阳性的单克隆送至北京擎科生物科技股份有限公司青岛分公司进行测序。将测序正确的阳性菌株进行质粒提取，-20℃保存备用。

1.2.4过表达载体的构建以提取的质粒为模板进行PCR扩增，然后参考文献中的方法进行过表达载体构建，所需引物见表1。经菌落PCR鉴定为阳性的单克隆菌液送至北京擎科生物科技股份有限公司青岛分公司检测，得到测序正确的表达载体pBI221-GFP-Rpbl。

1.2.5烟草瞬时转化在培养箱中种植小叶烟草（Nicotiana benthamiana，俗称本氏烟草），营养土盆栽；在光周期为16 h光照/8 h黑暗、温度23～26℃条件下培养约一个半月，选取浓绿、厚实的叶片用于瞬时表达实验。将pAMBI1300-miR9666、pAMBI1300-TmiR9666、pBI221-GFP-Rpbl质粒转化至农杆菌中，在双抗板上生长3天后，使用一次性注射器把不同农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉内进行瞬时转化，具体方法参考文献；将转化后的烟苗继续在培养箱中培养两天，然后撕下注射部位的表皮，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。

2结果与分析

2.1Tae-miR9666a的靶基因切割位点预测结果

预测发现Tae-miR9666a的靶基因为TraesCS7D02G297100，切割位点共有11个（表2）。通过小麦基因组网站（http：//wheatomics.sdau.edu.cn）对靶基因进行分析发现，TraesCS7D02G297100的基因组序列长度为8772bp，编码RNA聚合酶Ⅱ的大亚基Rpbl，共1860个aao Tae-miR9666a的切割位点位于Rpbl蛋白的C-端。

2.2Rpbl基因部分序列的克隆

为了保证扩增的靶基因部分序列连接到表达载体上能正常翻译且不移码，我们将引物设计在含有ATG的位置，然后利用中国春基因组进行PCR扩增，扩增片段大小为1655bp（图2A）；之后将扩增片段连接到克隆载体上，转化后菌落PCR鉴定结果如图2B所示。将阳性菌落进行测序发现，所获得的序列与TraesCS7D02G297100的部分序列完全一致，包含了Tae-miR9666a的所有结合位点（图3）。

2.3Rpbl基因部分序列的表达载体pBI221-GFP-Rpbl的构建

将含有Rpbl基因片段的质粒扩增后，利用重组酶连接到表达载体pBI221-GFP（图4），获得pBI221-GFP-Rpbl。为了检测连接产物的准确性，利用连接产物两侧的两个酶（BamHI和SalI）对pBI221-GFP-Rpbl进行双酶切，分别在4500bp和2000bp处出现两条带，与pBI221-GFP的大小（4530bp）和Rpbl基因片段的大小（1655bp）-致，表明pBI221-GFP-Rpbl载体构建成功。

2.4转化烟草及荧光鉴定结果

将构建的重组质粒以不同方式进行组合，即pBI221-GFP-Rpb1（记为Rpbl）与pAMBI1300-miR9666等量混合（记为Rpbl+miR9666）以及pBI221-GFP-Rpbl与pAMBI1300-TmiR9666等量混合（记为RpbI+TmiR9666）。以主叶脉为分界线将烟草叶片分为两部分，在第一片叶的两部分分别注射Rpbl+miR9666和Rpb1，在第二片叶的两部分分别注射RpbI+TmiR9666和Rpb1（图5）。两天后在激光共聚焦显微镜下观察烟草转化结果（图6），可见Rpbl+miR9666组合的荧光强度低，几乎无法检测到荧光信号；Rpbl+TmiR9666组合与Rpbl的荧光强度较高，且两者相近，表明miRNA前体的突变体未切割靶基因，导致GFP正常表达。

3讨论与结论

miRNA在植物的生长发育和逆境胁迫应答等生物学过程和农艺性状控制上起着重要作用。高通量测序技术的发展使miRNA的数目飞速增长，但是已知功能的miRNA数目却较少。小麦中已报道的miRNA为125条，但对其功能进行详细研究的却只有几条，如：miR156影响小麦的分蘖和小穗发育：Tae-miR408通过调控靶基因TaTOC来控制小麦的抽穗期：miR172可导致小麦穗的形态发生变化，其表达量降低导致小穗密集，而表达量升高则导致麦穗伸长，小穗之间的距离加大：过表达Tae-miR444a可提高植物的生物量、N含量、光合效率及抗氧化酶活性。因此，还需加强对众多miRNA功能的研究。

miRNA行使功能主要是通过切割靶基因或抑制靶基因表达进行。miRNA靶基因的识别主要是通过计算机软件预测，目前预测miRNA靶基因的软件主要有TargetFinder、PatScan、miRU、psRNATarget、miRGator等。这些预测软件的算法主要依赖于miRNA与靶基因的互补潜力进行预测，并强调种子序列的重要性。但由于预测过程中允许一定程度的错配、跳跃等情况，往往会导致许多错误的预测结果，因此在实际研究中，需要对预测结果进行进一步分析和验证。目前应用最广泛的miRNA靶基因的验证方法包括RNA連接酶介导的cDNA末端扩增技术、RISC免疫共沉淀技术和降解组测序技术，但这些方法的实验操作繁琐，结果也不直观，缺少一种快速简便验证miRNA靶基因的方法。

报告基因检测系统是新兴的验证miRNA与靶基因互作的研究手段。当miRNA与靶基因上的作用位点结合后，能有效抑制其翻译过程：然后将包含潜在结合位点的一部分或全部序列连接至报告基因CDS（coding sequences）的下游，并将构建好的重组质粒导人细胞内进行表达：同时将miRNA的模拟物或表达载体共同转染至细胞中，经过一段时间后检测荧光强度或者荧光素酶的活性来判断miRNA与靶基因的互相作用。目前该方法在动物和昆虫相关研究中已经开展实施，但在小麦miRNA靶基因的研究中还未见有报道。本研究通过合成小麦miRNA前体pre-miR9666及前体突变体pre-TmiR9666，连接到表达载体pAMBI1300上，并构建含有报告基因GFP标记的靶基因过表达载体pBI221-GFP-Rpbl，将两种载体共转化至本氏烟草叶片中，通过观察GFP的荧光强度来判断靶基因的切割情况，从而验证miRNA与靶基因的相互作用。结果发现共转miRNA前体的烟草叶片的荧光强度较低，表明靶基因被miRNA切割，其后的GFP无法进行较好的表达：共转miRNA前体突变体的烟草叶片与单转靶基因的叶片荧光亮度相当，表明miRNA前体的突变体未切割靶基因，导致GFP正常表达。本实验有效证明了miRNA的靶基因切割情况，表明利用烟草验证miRNA与靶基因互作是可行的。该方法可为小麦miRNA功能研究提供技术支持。