缺氧诱导因子通过Notch信号通路对上皮间质转化调控作用的研究进展*

陈 晓,李坤平 综述,方永平△ 审校

(1.广东医科大学第一临床医学院,广东 湛江 524023;2.广东医科大学惠州第一临床医学院,广东 惠州 516000)

缺氧诱导因子(HIFs)家族是参与调节细胞代谢的细胞因子,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。HIFs的主要功能包括促进肿瘤发生、血管生成、生长、转移、调节肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、调控能量代谢密切相关[1]。HIFs高表达于肿瘤组织,分布于肿瘤微环境,与多种肿瘤细胞的上皮-间质转化(EMT)过程相关[2]。Notch信号通路通过与EMT相关的转录和生长因子发生串扰,参与多种肿瘤细胞的 EMT过程[3]。HIFs可能直接或间接通过Notch信号通路在包括肝细胞癌(HCC)在内的肿瘤细胞 EMT 过程中发挥效应。现对HIFs促进肿瘤细胞 EMT,特别是对HCC EMT的调控作用及Notch信号通路在该过程的可能作用进行简要综述,为探索肿瘤新的治疗靶点提供依据。

1 HIF生物学特性及其与肿瘤进展的关系

1.1HIF 的生物学特性 1991年,SEMENZA和WANG在实验研究过程中发现一种缺氧诱导性核因子,其能与促红细胞生成素基因的启动子结合并增加其表达[4],在1995年确定这种核因子为HIFs,此后学者们开始广泛对HIFs进行更为深入的研究。HIFs是一种异源二聚体转录因子,其包含3个主要的氧不稳定HIF-α亚单位(HIF-1α、HIF-2α和HIF - 3α)和1个组成型HIF-β亚单位(也称为“ARNT”,包括ARNT1/2/3)[5]。α亚基的分子量是120×103～130×103;β亚基的分子量为91×103～94×103,α和β亚单位都属于转录因子的基本家族,包括螺旋-环-螺旋和PAS结构域,介导异二聚化和DNA结合。HIF-1α和HIF-2α的羧基末端结构域由调节其稳定性(氧依赖性降解结构域)和转录活性(2个反式激活结构域,N-TAD和C-TAD)的结构域组成。此外,α亚单位的C-和N-末端都有核定位信号,将它们导向细胞核[6-7]。HIF-1α和HIF-2α具有48%的氨基酸序列同一性和相似的蛋白质结构,它们主要在N-TAD结构域内不同,而HIF-3α在螺旋-环-螺旋和PAS结构域与HIF-1α和HIF-2α相似,但缺少C端反式激活结构域[8]。HIFs与其受体结合后产生生物学效应,3个HIF-α亚单位都表现出氧调节蛋白的稳定性,在正常氧浓度下,羟化酶、脯氨酸羟化酶和抑制HIF-1对α亚单位进行多泛素化和降解并保持低HIF蛋白水平和转录活性[9]。而在缺氧情况下,HIF-α亚单位被稳定并转运到细胞核,与HIF-β形成异二聚体,并结合靶基因调节元件内的缺氧反应元件,激活数百个对低氧耐受的基因并驱动低氧反应元件基因转录,以促进肿瘤的发生发展[10]。

1.2HIFs在肿瘤组织中的表达及其作用 近年来越来越多的实验表明,HIFs与促进肿瘤发生、血管生成、生长、转移、调节肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、调控能量代谢密切相关[11-12]。肿瘤为了在缺氧条件下存活,主要通过与缺氧转录因子的协同作用重新编程其新陈代谢、蛋白质合成和细胞周期进程,从HIFs的机制上讲,其主要通过调节编码水解糖酶的基因,血管生成信号基因和细胞凋亡/应激反应基因来调节癌细胞生长。在肺癌中,学者BECKER等[13]在研究中发现HIF-1α介导缺氧诱导的内皮细胞miR-186表达下调,进而通过上调蛋白激酶Cα促进非小细胞肺癌血管生成。而在XIONG等[14]研究中证实,HIF-1α和HIF-2α在缺氧条件下通过Sox2和Oct4调节非小细胞肺癌去分化,增加肿瘤的恶性增殖。缺氧信号与细胞信号通路相互作用以改变癌细胞恶性行为,肾透明细胞癌变体是最常见的肾上皮恶性肿瘤,携带Von Hippel-Lindau基因失活突变的患者使Von Hippel-Lindau基因功能丧失,进而导致HIF-2α通过激活缺氧敏感信号通路和HIF-2α靶基因的过表达来驱动肿瘤进展和转移,从而促进致癌潜力[15]。HIF-2α信号在2种人类结肠癌衍生细胞系中在氧气充足时被明显抑制,降低了集落形成、迁移和侵袭的活性。当以HIF-2依赖性方式补充外源乙酸盐时,人类结肠癌衍生细胞系的侧腹肿瘤在小鼠体内表现出增强生长[16]。而在乳腺癌的研究中,HIFs高表达,HIF-1α通过上调靶基因PLXNB3,进而诱导MET/SRC/FAK和 MET/SRC/STAT3/NANOG 信号传导,增强乳腺癌细胞迁移、侵袭和癌症干细胞增殖[17]。在Natalie的研究中,缺氧条件下使用甲苯咪唑在蛋白质水平上阻止HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的诱导作用,起到了抑制乳腺癌细胞系和乳腺癌临床前模型中HIFs转录活性的效果,进而降低了肿瘤的侵袭性,进一步体现了HIFs的促癌作用[18]。而在胃癌中,与其他几种肿瘤相似,HIF-1α的高表达与胃癌的恶性表型和生存率下降高度相关[19]。

1.3HIFs在HCC中的表达及作用 HIFs和HCC之间的关系极其复杂,两者涉及肿瘤代谢、免疫逃逸、血管生成、转移、细胞外基质重塑和癌症干细胞的活性。其中,HIFs调节HCC的代谢及肿瘤免疫逃逸的机制,HIFs主要通过以下3种机制调节肿瘤细胞的代谢以促进肿瘤发展:(1)通常与Warburg效应有关,HIF-1α增加葡萄糖代谢和糖酵解中关键酶的活化,进而促进代谢[20];(2) HIF-1α诱导几种糖酵解蛋白亚型的过度表达和活性增加,包括GLUT1和GLUT3[21];(3)HIF-1的转录活性增加了线粒体相关酶的表达,因此降低线粒体的氧化磷酸化水平和氧消耗[22]。而在肿瘤免疫逃逸中,HIFs诱导肿瘤细胞对CD8细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的抗性,其中涉及的机制包括抑制凋亡和激活自噬[23-25]。此外,缺氧可以上调产生腺苷的胞外酶CD39和CD73的表达,结合其A2A受体强烈抑制活化的CD8细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的抗肿瘤功能[26]。HIFs还可以通过作用于巨噬细胞渗透肿瘤微环境来抑制针对肿瘤的免疫反应[27]。总之,HIFs在不同恶性程度的HCC组织中过度表达,通过包括上述的多种途径综合影响肿瘤细胞进展,肿瘤分级越高,其表达水平越高,疾病预后越差。

2 HIFs与EMT的关系

2.1EMT在肿瘤侵袭转移中的作用 EMT是指上皮细胞中发生的形态学变化,固定的细胞脱离基膜变得可迁移,如细胞顶端-基底极性的丧失及紧密连接、黏附连接和桥粒的解体、细胞黏附分子,特别是对上皮细胞连接和根尖基底极化有重要作用的E-钙黏蛋白被下调等[28]。相反,波形蛋白、纤连蛋白和N-钙黏蛋白上调,促进向运动状态的转变,进而打破了上皮细胞之间及细胞和细胞外基质之间的内聚性结构完整性的特征,使这些细胞获得运动能力,同时这也是恶性肿瘤发生侵袭和转移的重要细胞学基础[29]。肿瘤细胞EMT对于获得肿瘤干细胞样特性至关重要,包括自我更新、抗凋亡、肿瘤进展和转移[30]。肿瘤细胞受到多种EMT诱导因子(如锌指转录因子、Twist转录因子、生长因子)及涉及多种信号通路(如Annexin1/Vimentin/S100A9、Wnt/β-catenin、CXCL8/FAK、TGF-β1/Smad2/MMP-9、Notch1、JAK2信号转导与STAT3信号通路等)调节EMT,进而促进恶性肿瘤的转移及侵袭[31-36]。上述这些通路并非处于绝对独立的状态,而是彼此产生相互促进或抑制的叠加作用,进而影响肿瘤特性作用。

2.2HCC细胞EMT的特性 EMT的作用特性给予了肿瘤细胞极强的迁移和侵袭能力,这也决定了EMT在恶性上皮性肿瘤的侵袭和转移中起关键作用。HCC源于肝脏细胞上皮性肿瘤,具有典型的上皮细胞特征,HCC中的EMT过程在决定肿瘤恶性程度上有着举足轻重的地位。HU等[37]研究发现,MAP4和GSK3β相互作用诱导的β-连环蛋白活性的上调可能是加速HCC细胞EMT效应的原因,MAP4通过调节GSK3β/β-连环蛋白途径促进HCC细胞EMT的过程,进而促进HCC的迁移及侵袭。有研究表明,癌症相关成纤维细胞在诱导化学耐药性中起重要作用,癌症相关成纤维细胞衍生的SPP1通过整合素-蛋白激酶Cα信号通路,激活致癌信号和EMT,促进增强HCC的耐药性[38]。我国学者发现,FBXO43在HCC患者组织中上调,并与不良临床病理特征呈正相关,同时,FBXO43高表达的HCC患者总生存期和无病生存期较短,研究者敲除FBXO43抑制了HCC细胞的EMT过程,证明FBXO43与细胞周期蛋白D1相互作用,通过多泛素化促进其稳定性,加速其EMT,促使HCC细胞增殖迁移[39]。以上证据表明,HCC细胞的EMT中涉及多种信号通路传导及转录因子,多种因素可以通过介导EMT过程来影响HCC的迁移、侵袭、耐药等,这进一步证明了EMT是HCC调控的关键步骤,同时也间接提示了这些信号通路及转录因子可能作为肝癌转移的预测性分子标志物及肝肿瘤治疗的分子靶标,为肿瘤治疗的精准性、靶向性提供新思路。

2.3HIFs与EMT的关系 EMT中关键信号通路的表达是代谢异常类型的主要调控因子,HIF-α就是其中之一,异常的肿瘤代谢促进EMT和转移能力,EMT也能够反向调节癌症代谢,通常情况下,HIF-α作为调节2个生物学过程的连接分子,同时赋予癌细胞恶性表型[2]。缺氧条件诱导EMT的发生,HIF与多种基因启动子上的缺氧反应元件结合,开始调节蛋白质的表达并启动EMT过程,其控制细胞骨架蛋白的表达并改变细胞的动态能力[40]。如在前列腺癌的研究中[41],HIFs下调上皮细胞标志物E-钙黏蛋白的表达,并上调N-钙黏蛋白,改变细胞骨架蛋白结构,增加癌细胞上雄激素受体的表达,促进肿瘤细胞EMT,维持前列腺癌的生长和存活,以及其去势抵抗性的发展,这种转化发生在癌细胞失去细胞间黏附并开始侵袭和转移时刻,激活不同的信号通路取决于缺氧的不同程度,促进肿瘤进展的同时保持前列腺癌细胞的自我更新、潜能和抗凋亡功能。

另一方面,缺氧条件是肿瘤干细胞保持干细胞干性的重要机制,通过TGF-β、Notch和Wnt-β-连环蛋白信号通路等刺激癌细胞中EMT转录因子Snail、Twist、Zeb1、Slug和Sip1的表达,在缺氧条件下积累这些因子与增强子盒结合进而增强EMT,与此同时这些EMT转录因子反过来诱导干细胞标记物的转录[42-43],进而促进肿瘤的侵袭和转移。

3 Notch信号通路与EMT、HIF的关系

3.1Notch 信号通路及其生物学作用 Notch 信号通路是一种生物进化中高度保守的信号转导通路,参与多种疾病的发生发展,在多种细胞的增殖、分化和凋亡,以及肿瘤发生、侵袭和转移中发挥重要作用[44]。在哺乳动物中,有4种Notch受体(Notch1/2/3/4)和5种配体(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)。典型的Notch信号传导是由g-分泌酶介导的Notch受体裂解启动的,导致Notch细胞内活性结构域的释放,其迁移到细胞核并与CSL相互作用,导致下游靶基因的激活,不同的配体可以在信号接收细胞中产生不同的Notch活性动力学,通过激活不同的靶基因程序诱导不同的细胞命运[45]。有研究显示,在HCC患者中,Notch1的表达与预后不良呈正相关,激活的Notch信号通路促进HCC细胞的干性,再次证明Notch信号通路的促癌作用[46]。此外,Notch信号通路已被证实参与多种人类恶性肿瘤生长迁移及侵袭过程,包括肾癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌及结直肠癌等。

3.2Notch 信号通路与EMT的关系 Notch可以通过与EMT相关的非编码RNA发生串扰,协调肿瘤细胞的EMT过程,进而干预肿瘤进展过程。YAN等[47]在实验研究中证明,长链非编码RNA ILF3-AS1通过miR-628-5p/meis 2轴激活Notch通路促进HCC细胞迁移、侵袭和EMT过程。LI等[48]研究发现,miRNA-139-5p可以在体内外通过Notch1信号靶点对胶质瘤的肿瘤活性起到抑制作用,作用机制包括:(1)miRNA-139-5p通过抑制Notch1,导致Snail的下降,从而抑制肿瘤EMT、侵袭和转移;(2)miRNA-139-5p降低N-钙黏蛋白、波形蛋白和纤连蛋白的活性及表达,而上调E-钙黏蛋白。类似地,CHEN等[49]使用miRNA-424-3p对垂体腺瘤细胞的作用进行了另一项研究,其证明过表达的miRNA-424-3p对靶点Jagged1的负性作用,并随后降低MMP-2和波形蛋白进而抑制肿瘤细胞EMT、增殖和转移。

此外,Notch信号通路也可以通过与EMT相关的转录和生长因子(如Snail、Slug、Twist1、TGF-β1等)调控肿瘤细胞的EMT过程。TGF-β1是一种参与细胞分化、增殖和凋亡的多功能细胞生长因子,YAZAKI等[50]研究证明了ROS-Nrf2通路通过激活Notch信号通路介导TGF-β1诱导的上皮间质转化,揭示了Notch信号在TGF-β1诱导的EMT发展中的关键作用。在胆管癌研究[51]中,胆绿素还原酶B耗竭加速胆管癌的EMT,胆绿素还原酶B受抑制激活了Notch信号传导,并通过上调Snail表达水平进一步增强Notch信号通路促进EMT,从而增加胆管癌中的细胞迁移和侵袭。Notch1信号靶点可以通过调控EMT转录因子Twist下调E-钙黏蛋白的表达,上调波形蛋白和N-钙黏蛋白的表达,进而促进EMT[52]。而Slug可以通过调节血管内皮细胞中的Dll4-Notch-VEGFR2轴,进而控制内皮细胞活化和血管生成,调节EMT[53]。

3.3Notch信号通路与HIF的关系 Notch信号通路在控制细胞命运起着关键作用,HIF信号通路是对缺氧的生理和病理反应中的主要调节器,Notch信号传导和缺氧之间的联系首次被提及是在JÖGI等[54]的实验研究中,该实验发现Notch靶基因Hes1在缺氧的神经母细胞瘤细胞系中被上调。此外,IRSHAD等[55]在对胶质母细胞瘤中Notch和缺氧激活基因的研究中也证实了这2种途径的联合基因特征及其在影响肿瘤不良预后中的作用。

HIFs作为细胞缺氧反应的全局调节因子,可以与Notch相互作用,直接调节Notch信号通路,Notch信号与细胞缺氧反应之间的交叉协同作用会促进不同癌症的进展,作用机制主要是HIF-α被招募到Notch反应性启动子,并与Notch胞内结构域相互作用,导致Notch胞内结构域的稳定和Notch下游基因的激活[56]。另外有研究发现,低氧诱导的Notch配体(如Jagged2和DLL4)的上调导致Notch信号的激活,也是两者产生直接协同作用的关键机制[57-58]。值得注意的是,HIFs除了能够直接调节Notch信号通路,也可以对Notch信号起到间接调控作用,如在关于肺癌的研究中,HIF介导的miR-1275上调发挥了致癌作用,通过共同激活Notch和Wnt/β-catenin信号传导途径,进而促进肺癌的发生发展。另一方面,Notch信号也可以调节缺氧反应,Notch可以通过HIF-1α到HIF-2α的转换在某些肿瘤细胞中转录上调HIF-2α的表达[59]。总而言之,Notch信号和细胞缺氧反应之间的串扰是广泛的,两者相互作用的机制复杂,Notch-hypoxia串联已经参与了各种生理和病理过程。

4 小结与展望

在HIFs家族里,虽然不同的α亚基在机体不同器官部位表达的作用有所差异,但在HCC等肿瘤细胞EMT过程中发挥重要作用。Notch信号通路参与机体代谢,不仅在细胞增殖、分化和凋亡过程发挥重要作用,以及在参与调控癌症相关通路具有极强的复杂性,并与 EMT和HIFs有密切关联,在HIFs促进HCC等肿瘤细胞EMT过程中起重要作用。因此,研究HIFs对HCC等肿瘤EMT的调控作用及其相关可能的机制,探讨Notch信号通路在此过程中的作用,对抑制HCC等肿瘤的进展,改善患者预后具有良好应用前景,有望为优化HCC等肿瘤的治疗和制订新的治疗策略提供依据。