血清LncRNA FAF、ITIH4在慢性心力衰竭患者中的表达意义及对预后的预测价值

江洋,刘泽岩,叶丽,汪栋林,程景林,万俊

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是一种临床综合征,是多种心脏疾病的终末期表现,与急性心力衰竭相比,CHF病情较长,对机体损害较大,更容易在某种诱因的作用下突然加重,危及生命[1]。遗传因素已被证明在心力衰竭的发病机制中起核心作用,长链非编码核糖核酸(LncRNA)是一组转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA,以RNA的形式参与生物过程,已有研究表明LncRNA在CHF中发挥着关键作用[2]。成纤维细胞生长因子相关因子(fibroblast growth factor-related factors,FAF)是一种与心血管疾病相关的LncRNA,研究显示LncRNA可通过上调成纤维细胞生长因子(FGF9)表达,激活磷酸化肌肽3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路,抑制缺血缺氧心肌细胞凋亡[3]。间α胰蛋白酶抑制因子重链4(inter alpha trypsin inhibitor heavy chain 4,ITIH4)是一个炎性反应生物标志物,可抑制炎性反应、脂质过氧化和动脉粥样硬化,血清ITIH4水平降低被证实与急性缺血性脑卒中患者炎性反应升高、复发风险增加及病死率升高相关[4]。冠心病患者血清ITIH4水平显著降低,低水平ITIH4与冠心病狭窄程度加重及主要不良心血管事件风险有关[5]。但LncRNA FAF、ITIH4与CHF的关系尚不清楚,目前缺乏相关报道。鉴于此本研究拟检测CHF患者血清LncRNA FAF、ITIH4表达,分析其与CHF预后的关系,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年1月—2022年1月安徽医科大学第二附属医院急诊内科收治的CHF患者187例为CHF组,男112例,女75例,年龄55～77(65.87±8.19)岁,再根据NYHA心功能分级[6]分为Ⅱ级亚组65例、Ⅲ级亚组77例、Ⅳ级亚组45例;另选择同期于医院体检中心体检的健康志愿者103例为健康对照组,男65例,女38例,年龄56～78(65.11±8.12)岁。2组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得医院伦理委员会批准(YX2019-003),受试者及其家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南(2018)》中CHF诊断标准[7];②纽约心脏协会(NYHA)心功能分级Ⅱ～Ⅳ级;③年龄18岁以上。(2)排除标准:①急性心力衰竭、急性心肌梗死、不稳定型心绞痛等心脏疾病;②恶性肿瘤,包括实体瘤和血液学恶性肿瘤;③既往接受心脏手术患者;④急慢性感染、自身免疫疾病、严重肝肾功能障碍。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 临床资料收集:收集CHF患者性别、年龄、体质量指数、吸烟史、饮酒史、基础疾病、NYHA分级、血常规(白细胞计数、中性粒细胞计数)、血生化(三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、超声心动图[左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室射血分数(LVEF)]等。

1.3.2 血清LncRNA FAF及ITIH4检测:患者于入院翌日晨/健康对照组体检当日采集空腹静脉血5 ml注入干燥试管,室温静置后取上层液离心留取上清液待测。以GenEluteTM总RNA纯化试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)从血浆中提取总RNA,紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度、浓度和完整性,Revert Aid RT逆转录试剂盒(美国赛默飞公司)将总RNA逆转录为cDNA。CFX96 TouchTM实时PCR检测系统(美国Bio-Rad公司)进行qRT-PCR反应,PCR体系:cDNA 1 μl,上下游引物各0.4 μl,2×SYBR Green混合液10 μl,ROC参比染料(50×) 0.4 μl,加ddH2O至20 μl。PCR条件: 95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s, 60 ℃退火延伸15 s,共40个循环。引物序列:LncRNA FAF,上游,5′-CGCTAAAGGCACAGGGTCAG-3′,下游,5′-CACCAACCTTTCCCTTCCAGTC-3′;GAPDH(内参),上游,5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,下游,5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。LncRNA FAF引物和内源性对照GAPDH引物由上海Gene Pharma公司设计合成。使用2-ΔΔCT法评估LncRNA FAF表达。

取血清样本,采用酶联免疫吸附试验检测血清ITIH4水平,ITIH4试剂盒购自上海欣维宇生物科技有限公司,仪器为德国BMG LABTECH酶标仪。

1.3.3 随访:CHF患者参考文献[6]进行规范化治疗,出院后电话或门诊随访12个月,记录随访期间主要不良心血管事件(MACE)发生率。MACE定义为心力衰竭再住院和全因死亡。根据MACE的发生情况将患者分为MACE亚组41例和非MACE亚组146例。

2 结 果

2.1 2组血清LncRNA FAF及ITIH4表达比较 CHF组血清LncRNA FAF表达、ITIH4水平低于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 健康对照组和CHF组血清LncRNA FAF及ITIH4表达比较

2.2 CHF患者不同NYHA分级亚组血清LncRNA FAF及ITIH4表达比较 血清LncRNA FAF表达、ITIH4水平Ⅳ级亚组低于Ⅲ级亚组低于Ⅱ级亚组,差异均有统计学意义(P<0.01), 见表2。

表2 不同CHF心功能分级患者血清LncRNA FAF及ITIH4表达比较

2.3 MACE亚组和非MACE亚组血清LncRNA FAF及ITIH4比较 MACE亚组血清LncRNA FAF表达、ITIH4水平低于非MACE亚组,差异均有统计学意义(P<0.01),见表3。

表3 非MACE亚组和MACE亚组血清LncRNA FAF及ITIH4表达比较

2.4 非MACE亚组和MACE亚组临床资料比较 MACE亚组患者年龄、NYHA分级Ⅳ级比例、血清NT-proBNP水平大于/高于非MACE亚组(P<0.05), LVEF低于非MACE亚组,差异均有统计学意义(P<0.01),见表4。

表4 非MACE亚组与MACE亚组临床资料比较

2.5 影响CHF患者发生MACE的多因素Logistic回归方程分析 以CHF患者随访期间是否发生MACE为因变量(赋值:0=否,1=是),以年龄、NYHA分级(赋值:0=Ⅱ和Ⅲ级,1=Ⅳ级)、NT-proBNP、LVEF、LncRNA FAF及ITIH4为自变量,进行多因素Logistic回归分析,结果显示:NYHA Ⅳ级、高水平NT-proBNP是CHF患者发生MACE的危险因素(P<0.01),高表达LncRNA FAF、高水平ITIH4是其保护因素(P<0.01),见表5。

表5 影响CHF患者发生MACE的多因素Logistic回归方程

2.6 LncRNA FAF及ITIH4预测CHF患者发生MACE的价值 绘制LncRNA FAF及ITIH4预测CHF患者发生MACE价值的预测效能ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示:LncRNA FAF、 ITIH4及二者联合预测CHF患者发生MACE的曲线下面积为0.796、0.801、0.896,二者联合预测曲线下面积高于单独预测(Z=2.453、2.404,均P<0.001),见表6和图1。

图1 LncRNA FAF及ITIH4预测CHF患者发生MACE的ROC曲线Fig.1 ROC curve of LncRNA FAF and ITIH4 for predicting MACE in CHF patients

表6 LncRNA FAF及ITIH4预测CHF患者发生MACE的ROC曲线参数

3 讨 论

心脏的主要功能是维持正常的心输出量,心内充盈压力不足引起心力衰竭会导致周围水肿、肺水肿和疲劳、呼吸困难等症状,不少CHF患者可在确诊后5年内死亡[8]。LncRNA通过调节相关基因的表达在心力衰竭中发挥关键作用,目前已有研究证实部分LncRNA参与CHF的发病机制,如LncRNA GASL1靶向负性调控TGF-β1抑制心肌纤维化和心肌细胞凋亡,在CHF中发挥保护作用[9]。LncRNA HOTAIR靶向抑制miR-30a-5p上调KDM3A表达减轻氧化应激和CHF心脏损伤[10]。

LncRNA FAF是在心血管疾病中发现异常表达的LncRNA,和FGF9位于同一染色体上,可通过反向互补组合。FGF9属于成纤维细胞生长因子(FGF)超级家族,与FGF受体结合触发其磷酸化,随后激活PI3K/AKT和丝裂原细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)信号通路,诱导心肌细胞增殖[11],心肌梗死大鼠心肌组织中FGF9表达下调,上调FGF9表达可增加微血管密度,抑制间质纤维化,增强收缩功能,降低心肌梗死后心力衰竭病死率[12]。本研究发现CHF患者的LncRNA FAF表达下调,既往研究认为LncRNA FAF过表达可上调FGF9表达,抑制转化生长因子β1/Smad2/3信号通路,显著减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞增殖、分化和胶原积累的增加,抵抗心肌纤维化[13]。进一步分析发现LncRNA FAF低表达与CHF患者NYHA分级增加有关,提示LncRNA FAF表达下调可能加速心力衰竭进程。分析其原因为LncRNA FAF过表达通过海绵miR-185-5p促进P21活化激酶2在心肌细胞中表达,减轻心肌细胞焦亡,提高细胞存活[14],继而发挥心肌细胞保护作用,改善心功能,而LncRNA FAF水平降低则可促进缺血缺氧心肌细胞的凋亡[3]。另外,高表达LncRNA FAF是CHF患者发生主要不良心血管事件的保护因素,LncRNA FAF过表达可能通过抑制心肌细胞纤维化和凋亡在CHF中发挥保护作用,上调LncRNA FAF表达可能有助于改善CHF患者预后。

炎性反应是CHF发病和进展的关键,心脏损伤后巨噬细胞活化,募集单核和中性粒细胞从脾脏大量浸润到心肌组织中,促进炎性反应,成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,促使心肌细胞凋亡和心肌纤维化,诱导心力衰竭[15]。ITIH4属于α-胰蛋白酶抑制剂家族,主要由肝脏分泌,在感染诱导的炎性反应和器官损伤中起着重要作用。研究显示ITIH4可灭活脓毒症小鼠核因子κB(NF-κB)和细胞外信号调节激酶(ERK)途径,抑制炎性反应细胞因子的分泌,血清ITIH4水平降低与疾病严重程度和28 d病死率增加有关[16]。炎性肠病患者血清ITIH4水平降低,与疾病活动性增加以及临床治疗反应低下有关[17]。本研究发现CHF组患者血清ITIH4水平降低。分析原因为ITIH4缺失可能加剧心肌纤维化和心肌细胞凋亡,导致CHF的发生。此外,CHF患者血清ITIH4水平随着NYHA分级的增加而降低,推测ITIH4缺失可能促进炎性反应,引起大量炎性反应介质释放和心肌组织单核细胞及中性粒细胞浸润,成纤维细胞增殖,发生肌成纤维细胞转化,大量细胞外基质蛋白沉积,促使心肌纤维化和异常重塑,加剧心功能减退。Logistic回归分析显示高ITIH4水平是CHF预后不良的保护因素,提示增高ITIH4水平可降低CHF预后不良的风险,ITIH4可能作为CHF潜在治疗靶点。

ROC曲线分析LncRNA FAF、ITIH4在CHF预后预测中具有较高价值,联合预测效能更高,LncRNA FAF、ITIH4可能作为CHF预后的新标志物。另外,Logistic回归分析结果显示NYHA分级Ⅳ级、高水平NT-proBNP是CHF患者发生MACE的危险因素,这是因为NYHA分级越高心功能越差,发生不良预后风险越大[18]。高水平NT-proBNP被认为是CHF的生物学标志物[19]。

综上,CHF患者血清LncRNA FAF表达和ITIH4水平均降低,低表达LncRNA FAF和低水平ITIH4与CHF患者心功能降低以及不良预后有关。联合检测LncRNA FAF、ITIH4可预测CHF患者预后不良风险。本研究首次证实LncRNA FAF和ITIH4与CHF的关系,为临床预后分析和治疗提供了新的标志物和靶点,但也存在一定局限性,本研究为单中心研究,可能导致选择性偏倚,样本缺乏代表性,另外LncRNA FAF和ITIH4参与CHF的具体机制尚不清楚,尚待进一步开展基础研究证实。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

江洋:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;刘泽岩:实施研究过程,分析试验数据;叶丽:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;汪栋林:进行统计学分析;程景林:数据收集、分析整理,论文撰写;万俊:提出研究思路,论文审核