甲基化PAX1在宫颈癌筛查和预后评估中的临床应用

刘 静

(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤妇科,安徽 蚌埠 233000)

宫颈癌被认为是影响女性生育能力的重要疾病,其发病率极高。宫颈癌是一种危害性极大的恶性肿瘤,在发展中国家和地区的发病率和死亡率均高于其他癌症,排名第四位。近10年来欧美主要国家采取的宫颈癌初筛、阴道镜检查和组织病理学检查三步法显著降低了宫颈癌的死亡率[1]。而且人乳头瘤病毒(HPV)预防疫苗的使用也取得了显著的效果,进一步减少了宫颈癌的发病率。虽然宫颈癌的诊断和治疗取得了一定的进展,但它仍然是我国女性生命安全的潜在威胁之一。2022年宫颈癌新增11.93万例,死亡3.19万例,根据国家癌症中心公布的数据,宫颈癌呈年轻化趋势,目前我国宫颈癌初筛方案是细胞学和高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)检测单独或联合检测。近年来,液基薄层细胞学检查(TCT)的应用越来越广泛,它不仅提高了细胞学检查的精度,而且还能够更有效地检测到未明显的非典型鳞状上皮细胞[2],尽管目前全球范围内的宫颈癌筛查方法学依旧采用巴氏涂片(TBS),但液基薄层细胞学检查的应用也越来越广泛,它可能会提高检测的灵敏度,从而更好地预防宫颈癌的发生。由于细胞学诊断的准确率受到50%～70%的影响,由于每位细胞病理师的个体差异,导致他们的准确率往往会受到影响,从而使得子宫颈癌和更严重的疾病的发现率更高,因此,许多医院会采取措施来减少这种漏检的情况,如通过阴道镜和活检来确定疾病的类型。美国阴道镜与宫颈病理学会建议,当发现有低度磷状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)等病理改变时,应尽快采取阴道镜检查,以确定病理的程度以及是否存在不典型的病理。当细胞学检验显示ASCUS,则应该考虑对HR-HPV感染的检测,并在半年之内接受细胞学检验。若HPV呈阳性,则应该接受阴道镜检查,若未能得出准确的诊断,则应该及时前往医院接受宫颈癌细胞学检查。研究发现,超过九成的女性都曾被HPV病毒所侵袭,但其中绝大多数只是暂时性的,未必会发展成癌症。其中,HR-HPV类型有八种,即16、18、31、33、35、45、52、58,其中HPV16和HPV18的阳性率高达76%,研究表明,HPV的长期感染会导致宫颈癌的发生。然而,阴道镜并不能确定是否感染HPV。在这种方法中,高危型非HPV16/18型别感染者可能会出现ASCUS或更高的类型。随着中国政府采取措施,将HPV感染的风险降到最低,但这种做法仍然导致许多女性因HPV感染引发的焦虑,从而导致她们不断地寻找治疗方案,从而增加了对于医疗资源的消耗和经济压力。根据流行病学研究,许多女性一生中都曾经感染过HPV,但只有10%的人会持续感染,进而转化成宫颈癌。这说明宫颈癌的形成与许多原因有关,如基因变异和遗传性易感突变,应该尽力采取措施来防止宫颈癌的进一步恶变[3]。近期的全球范围内的临床试验表明,子宫颈癌基因的甲基化水平高度增加会导致宫颈癌的发生,特别是PAX1配对盒基因1的甲基化水平增加会导致子宫颈鳞癌的发生。许多实践结果表明,PAX1基因甲基化水平的检测可以作为多种预防措施的一部分,因此,本研究旨在探索PAX1基因甲基化水平对于宫颈病变的早期发现、早期预防乃至早期治疗的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2021年1月～2021年12月在蚌埠医学院第一附属医院接受治疗的150例HPV感染患者为研究对象,根据疾病类型和FIGO的临床评估标准将他们划分成四组:对照组48例,低级别上皮内瘤样变组38例,高级别上皮内瘤样变(HGCIN)组35例和癌变(ICC)组29例。对照组的平均年龄为(35.6±2.1)岁,LGCIN组的平均年龄为(38.5±2.1)岁,HGCIN组的平均年龄为(37.7±1.4)岁,ICC组的平均年龄为(37.2±2.5)岁。四组患者的一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准:①年龄21岁以上女性;②有性生活史;③深入了解研究流程,已签署ICF,并且完成了所有相关手续;④经过多种检测方法,包括HR-HPV、TCT和PAX1基因甲基化,取得了良好的结果。排除标准:①对于那些曾患有宫颈癌前期病变或其他女性生殖系统恶性肿瘤的患者,建议进行治疗以改善病情;②临床标本项目缺失;③已接种过HPV疫苗者;④孕产妇及哺乳期女性;⑤已行子宫全切术。

1.2方法

1.2.1宫颈标本采集:患者取截石位,以常规消毒、铺巾,取出宫颈病变部位细胞制备宫颈刮片,然后使用标准的消毒剂和清洁剂来清洁病变区域。之后,医生会在阴道镜下行宫颈病变处活检,并对其进行病理学检测。最后,通过HPV检测将样本放置在低温环境中。经过精心的宫颈刮片和PAX1病理学检查,可以准确检测ACKPAX1基因的甲基化水平。

1.2.2宫颈DNA提取、化学修饰与扩增:分别提取出宫颈DNA经亚硫酸氢盐处理后安排进行PAX1基因转录(参照德国Qiagen公司生产试剂盒说明书),PAX1基因外侧上游引物、外侧下游引物:5′-AAGTTGATTTAGGGTTTGGGG-3′、5′-ACCCAGCTCATCCACACTCCC-3′。PAX1基因上游引物、下游引物:5′-GTGGAGACTGTGTCGGGAGGG-3′、5′-AAATACCCRAGACTAAACGC-3′。使用生物素来检测引物5′末端。

1.2.3焦磷酸DNA测序:根据焦磷酸测序仪的甲基化标准,可以制作出单链DNA模板,并对其进行测序。目的基因用引物(5′-GGAGGTAGGTTTTGGAG-3′)测PAX1基因9个胞嘧啶、磷酸、鸟嘌呤,经过PAX1基因测序可以准确地反映出每一个样本基因在特定检测位点上的甲基化程度。通过使用焦磷酸测序技术可以精确测定 9 个特定的靶基因的甲基化水平。该试剂盒包含内部 DNA。在样本分析中,通过观察每个位点的甲基化水平来衡量它在内部数据集上的分布情况,这种方法可以用来估算每个位点的甲基化程度。

1.3观察指标:通过4组组织检查,研究HPV感染的概率以及PAX1基因甲基化的程度;同时通过宫颈刮片检查,评估PAX1基因甲基化的程度;最后通过跟踪观察,探究四组患者的预后。

1.4统计学方法:采用SPSS20.0软件进行t、χ2检验与方差分析。

2 结果

2.1四组宫颈组织中HPV阳性率与PAX1基因甲基化发生率比较:通过观察四组组织样本,可以看出HPV阳性率和PAX1基因甲基化的情况有所不同。经过四组组织的研究,HPV阳性率和PAX1基因甲基化水平各组间差异显著(P<0.05)。见表1。

表1 四组病变组织中HPV阳性率与 PAX1 基因甲基化发生率比较[n(%)]

2.2四组宫颈刮片和宫颈组织中PAX1基因甲基化水平比较:通过四组宫颈刮片检查,发现PAX1基因在组织细胞内的甲基化水平存在显著差异(P<0.05)。经过四组宫颈刮片检查及组织分析,发现PAX1基因甲基化水平存在显著的变化,其变化程度具有一定的统计学意义(P<0.05),而癌变组的PAX1基因的甲基化水平则要远远超过正常组、低级别组及高级别组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 四组宫颈刮片检查PAX1基因在组织样本甲基化程度

3 讨论

在临床实践中,宫颈癌的发现通常需要数年或数10年的时间。在这段时间中宫颈癌的初期表现通常并不突出,直到它的严重程度增强才会被诊断出来。根据过去的研究,宫颈癌变进程涉及许多遗传和调节基因机制,当中DNA甲基化变化尤为突出[4]。这种变化会引起基因调控遗传的突变,从而影响基因功能,并有助于宫颈癌的形成和恶化。在宫颈癌患者体内,65%～95%的样本都会出现DNA甲基化变化。因而,基因甲基化技术可以被用来对宫颈脱落细胞和宫颈组织进行活体检查,从而帮助医生更准确地识别和预防宫颈癌[5]。

随着最新的诊断技术、细胞学研究的进步以及HPV的大规模应用,宫颈癌的早期症状已经得到了有效的检测与治疗,从而大大减少了宫颈癌的早期发现率。根据统计分析,感染HPV的人并不总是会患上癌症,这暗示着可能存在其他潜在的危险因素,可能会加速宫颈癌的发生和发展。随着基因和蛋白质水平的变化,一种新的、具有特异性的检测技术出现了。最新的研究显示,癌症患者的基因表达异常可能会对他们的健康造成严重的危害,包括影响细胞的增殖和分裂;此外,异常的甲基化也有可能导致抑制癌症的基因的表达,进而促进肿瘤的形成。根据最新的研究结果,PAX1基因的甲基化水平显著升高[6]。这种变化与宫颈癌的发病机制密切相关,而且宫颈癌患者的脱落细胞也能够发现这种甲基化的存在。最新的研究发现,PAX1基因的阳性甲基化水平可以作为宫颈癌的重要指示因素,它可以帮助医生更准确地识别宫颈癌的类型以及淋巴结的转移情况,从而为宫颈癌的早期诊断提供依据。当前许多研究都集中于定性检测PAX1基因的甲基化状态,但这种方法很难准确地量化和评估这一状态。

根据过去的研究,PAX1基因的甲基化能够提高宫颈癌的早期识别能力,研究表明,通过PAX1基因的甲基化能够更精细的检测脱落细胞以及活体组织,甚至能够替代50%的阴道镜检查[7]。研究表明PAX1基因甲基化的水平能够作为宫颈癌的一种有效的预防措施,它能够有效地将CIN2病变与正常组织的差异降低到0.66,而将CIN3病变的差异降低到0.77,将CIN3病变的差距缩小到0.92,并且能够有效地降低ROC曲线的下降幅度,从而提高宫颈癌的预防效果,这种方法的诊断效果非常好。

研究发现,结合细胞学和病毒学的双重技术,构建一个完善的宫颈癌筛查体系,能够有效降低宫颈癌的发生概率。相比于传统的阴道镜检测,这种双重技术更具有灵活性和准确性,能够有效减少患者的就医次数,从而极大地改善宫颈癌的早期发现和治疗效果。

在中国的宫颈癌患者中,ASC-US和非16/18型HR-HPV均呈阳性,这种情况非常普遍,并且需要进行多次的跟踪治疗,这将消耗大量的资源。宫颈癌仍然是一个严重的健康问题,由于人口众多、区域性医疗资源匮乏、卫生知识普及程度较低、规范的治疗方案实施困难以及专业读片医师的短缺,使得宫颈癌的发病率和死亡率都在不断上升,而且这种情况很难得到有效的缓解。虽然“两癌”的筛选工作受到了政府的高度重视,但目前还无法达到持久而有效的结果。根据北京大学人民医院的一项最新研究,超过一半的宫颈癌患者没有接受宫颈癌筛查,这说明宫颈癌的预防和控制仍处于初级阶段。

综上,通过对宫颈癌高危人群的定量研究,发现PAX1基因甲基化的存活率和定量水平都很高。这种定量技术具有高灵活性和高准确性,能够作为临床诊断的重要参考。