基于网络药理学的银花甘草汤治疗放射性肺炎的机制

傅燕红,廖小文,潘丁龙

(福建医科大学附属第二医院肿瘤放射治疗科,福建 泉州 362000)

放射治疗是恶性肿瘤重要的治疗手段之一,特别在胸部肿瘤的全程治疗中发挥着不可或缺的作用。然而,胸部放疗引起的放射性肺炎是放疗剂量限制的主要因素。据报道[1],肺癌行胸部放疗后,放射性肺炎的发生率高达15%～40%,严重影响了治疗效果及患者的生活质量。目前,放射性肺炎主要采用激素进行抗炎治疗,但是激素的使用不仅具有免疫抑制作用,还有发生二重感染的风险,甚至因治疗中断导致肿瘤的进展。因此,在临床上寻找高效、低毒的有效药物显得尤为重要。中医药是我国的传统医学,在某些疾病特别是慢性病的治疗中发挥着重要的作用,与西药相比,更具高效、低毒、经济的优点,但因中医药理论自成一体,且中药成分复杂,其对于疾病的治疗的分子机制不清,因此,运用细胞及分子层面水平对中药的作用机制进行阐述具有重要的意义。银花甘草汤收载于《医学心悟》,主要由金银花和甘草两味中药组成,其具有清热解毒的功效,兼具低毒、经济的优点。中医理论认为,放射线属“火热毒邪”,基于中医理论及少量的文献报道[2],认为银花甘草汤在治疗放射性肺炎方面具有一定疗效。本研究采用网络药理学方法,获取金银花、甘草对治疗放射性肺炎的主要成分及相应的作用靶点,构建成分-靶点网络图,并挖掘可能参与的生物学功能及作用的相关通路,从分子层面对其治疗放射性肺炎的机制进行阐述。

1 材料与方法

1.1中药化学成分的收集筛选:利用中药系统药理学分析平台数据库检索金银花、甘草的主要化学成分,以口服利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18作为筛选条件,筛选出具有较高生物利用度及类药性的化合物分子,并收集其相应的作用蛋白靶点,结合Uniport数据库进行蛋白靶点Gene Symbol的标准化处理。

1.2中药成分作用靶点的收集筛选:将筛选出的化合物在TCMSP数据库中进行作用靶点的收集,并将收集到的靶点蛋白在Uniport数据库中进行标准化处理,得到靶点蛋白相对应的Gene Symbol名称。

1.3放射性肺炎靶点的检索:以“Radiation Pneumonitis”为关键词在GeneCards数据库中进行放射性肺炎疾病靶点的检索,并收集Gene Symbol数据。进而将疾病靶点与中药活性成分靶点进行映射,得到银花甘草汤治疗放射性肺炎的潜在作用靶点。

1.4活性成分-药物靶点的网络构建:将筛选得到的中药活性成分和映射得到的作用靶点导入Cytoscape软件中进行活性成分-靶点网络图的构建,利用cytoHubba插件对构建好的网络进行重要节点成分及关键靶点的筛选,并绘制核心活性成分-药物靶点网络图。

1.5靶基因基因本体论(Go)富集和京都基因与基因百科全书(KEGG)通路分析:将筛选得到的关键靶点在Enrichr数据库中进行Go生物学过程分析和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1银花甘草汤化学成分及作用靶点筛选结果:以“金银花”“甘草”分别为关键词在TCMSP数据库中检索其化学成分,共检索到516个化合物,其中金银花236个、甘草280个。根据设定的筛选标准,共得到115个具有良好ADME(吸收、分布、代谢、排泄)性质的活性化合物,其中金银花23个、甘草92个。将筛选得到的23个金银花、92个甘草活性成分在TCMSP数据库中进行蛋白靶点收集,共收集到483个金银花作用蛋白靶点、1 773个甘草作用蛋白靶点,筛选去重后得到221个金银花蛋白靶点、239个甘草蛋白靶点。将去重后得到的蛋白靶点在Uniprot数据库中进行Gene Symbol标准处理,共得到362个,其中175个金银花、187个甘草的基因名称。见表1(OB值前10位的金银花、甘草成分)。

表1 银花甘草汤活性成分

2.2疾病靶点检索结果:在GeenCards数据库中以“Radiation Pneumonitis”为关键词共检索到559个放射性肺炎的相关靶点见表2(相关度得分排名前10位靶点蛋白)。

表2 放射性肺炎相关靶点

2.3有效成分-疾病靶点映射结果:将标准化处理后的金银花、甘草作用靶点与放射性肺炎相关靶点采用韦恩图进行映射,共得到PPARD、MMP2、HSPB1、HMOX1、NOS2等59个交集靶点。见图1。

图1 药物-疾病靶点映射图

2.4成分-靶点网络构建:根据筛选得到的362个活性成分和韦恩图筛选得到的59个作用靶点,利用Cytoscape软件构建成分-靶点网络图,该网络图包括155个节点,495条边。利用cytoHubba插件进行重要节点筛选,绘制核心成分-靶点网络图,共得到PTGS2、NOS2、AKT1、PRARG、MAPK14等5个核心作用靶点,得到MOL000422(山萘酚)、MOL000006(木樨草素)、MOL002773(β-胡萝卜素)、MOL000098(槲皮素)、MOL004805{(2S)-2-[4-hydroxy-3-(3-methylbut-2-enyl)phenyl]-8,8-dimethyl-2,3-dihydropyrano[2,3-f]chromen-4-one}、MOL000417(钙黏蛋白)、MOL000392(刺芒柄花素)、MOL003896(7-甲氧基-2-甲基异黄酮)、MOL003656(黄羽扇豆魏特酮)、MOL000354(异鼠李素)、MOL000497(甘草查尔酮A)、MOL004328(柚皮苷)、MOL002311(甘醇)等13个重要中药活性成分。见图2。

图2 核心成分-靶点网络图

2.5GO和KEGG富集结果:将筛选得到的5个核心靶点蛋白导入Enrichr数据库进行GO生物学过程和KEGG通路富集分析。GO分析共富集到MAP激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、丝裂原活化蛋白激酶结合、氧化还原酶活性、磷酸二苯酯-3,4-双磷酸二苯酯等13条P<0.05的生物学过程。见表3。KEGG分析共富集到VEGF信号通路、小细胞肺癌、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、脂肪溶解的调控、松弛素信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等61条P<0.01的相关通路。见表4(仅列出前20)。

表3 GO富集结果

表4 KEGG富集结果

3 讨论

胸部放疗不可避免的会对正常肺组织产生影响,放射性肺炎是其常见的早期并发症,治疗主要以激素为主,常缺乏特异性治疗手段,若不能及时有效控制甚至有可能出现呼吸衰竭危及生命,部分长期存活的肿瘤患者晚期出现肺纤维化严重影响生活质量。本研究采用网络药理学方法,利用中药数据库筛选出银花甘草汤的有效成分,结合疾病数据库进行作用靶点筛选,并构建网络图,继而对其生物学功能及参与的信号通路进行挖掘,对银花甘草汤治疗放射性肺炎提供分子层面的理论支撑。

本研究对TCMSP数据库检索到的银花甘草汤有效成分进行分析发现,山萘酚、木樨草素、β-胡萝卜素、槲皮素、钙黏蛋白、刺芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮等13个化合物是作用于放射性肺炎靶点重要的有效成分。山奈酚属于黄酮类化合物,已有研究表明,山奈酚可以抑制NO和前列腺素E2的释放,降低c-Jun和c-fos的转录活性,并抑制Src、syk、IRAK1和IRAK4等靶标分子的激活,从而起到抗炎活性,同时具有抗氧化和抗癌的作用[3-5]。王静[6]研究发现,山奈酚可以清除放射线辐射产生的活性氧(ROS)和一氧化氮(NO),降低丙二醛(MDA)水平,增加超氧化物歧化酶(SOD)水平,对减少辐射诱导的氧化应激和细胞凋亡发挥防护作用。白细胞介素(IL)-31和IL-33是许多炎性反应和病理疾病中表达的细胞因子,在炎性反应发生、发展过程中发挥着重要的作用。研究表明,木犀草素可从mRNA和蛋白水平抑制IL-33刺激的HMC-1.2细胞中IL-31的表达,木犀草素还抑制IL-33刺激的HMC-1.2细胞培养液中IL-31的分泌。进一步的研究结果表明,木犀草素能抑制IL-33刺激的HMC.1.2细胞中ERK、JNK、p38和NF-κBp65的活化[7]。此外,木犀草素还阻止了p65的核转位和与其DNA结合位点的结合。基于上述结果,木犀草素被认为可能是一种潜在的用于预防或治疗与IL-31和IL-33相关的疾病。β胡萝卜素是最丰富的类胡萝卜素,具有潜在的抗炎作用。最新研究表明,β-胡萝卜素通过抑制巨噬细胞中的NF-κB,JAK2/STAT3和JNK/p38 MAPK信号通路来减轻脂多糖诱导的炎性反应[8]。槲皮素最主要的效应是具有调节炎性反应的作用[9]。体外研究表明,槲皮素主要通过降低IL-1、IL-6、IL-10的表达量从而起到到抗炎的作用[10]。另外,槲皮素在脂肪细胞中也具有抗炎的作用,其机制主要与其通过AMPK/Sirt1途径对IL-12和一氧化氮酶(iNOS)的表达量进行调节有关[11]。以上研究结果均表明,银花甘草汤中的主要化学成分具有一定的抗炎作用。

本研究通过对核心靶点进行GO富集分析分析发现银花甘草汤中的主要成分参与了MAP激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、丝裂原活化蛋白激酶结合、氧化还原酶活性、磷酸二苯酯-3,4-双磷酸二苯酯等13个生物学过程,与放射性肺炎的发生、发展有着密切的关系。KEGG通路富集分析结果显示相关靶点主要参与了血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、小细胞肺癌、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、脂肪溶解的调控、松弛素信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等61条信号通路从而起到治疗放射性肺炎的作用。VEGF是一种特异性的促VEGF,具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性等作用,阿昔替尼(AG-013736)是一类具有选择性靶向VEGF信号通路的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂,Hillman等[12]研究发现在小鼠肺癌模型中其与放疗的结合具有减少肺炎、血管损伤及肺纤维化发生的作用。放射性肺肿瘤坏死因子α的产生与早期细胞凋亡和潜在肺功能损害有关,抑制肺TNFR1对肺有选择性地放射保护作用,而不影响肿瘤的反应,这些发现支持了利用抑制肿瘤坏死因子-α途径开发新的放射防护策略[13],提示肿瘤坏死因子(TNF)相关信号通路参与放射防护过程。IL17A是IL17家族中重要成员之一,郭雷鸣等[14]通过检测肺癌患者放疗前后血清IL-17A水平的变化情况发现放疗后放射性肺炎组与非放射性肺炎组血清中IL-17A水平存在明显差异,相关性检验发现IL-17A升高与放射性肺炎的发生呈正相关,提示IL-17A可能是较好的预测放射性肺炎的细胞因子,因此猜测IL17信号通路可能参与放射性肺炎的发生。综上所述,银花甘草汤中主要有效成分通过其核心靶点依靠VEGF信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等发挥抗炎、放射防护的作用。

本研究采用新兴的网络药理学研究方法对银花甘草汤治疗放射性肺炎的有效成分、活性靶点和可能的作用机制进行了初步的预测与探讨,为后续基础研究及临床应用提供一定的理论支持。但是以上研究仅依靠生物信息学、相关数据库挖掘及部分文献数据支持,可能存在偏差,具有一定的局限性,对于银花甘草汤治疗放射性肺炎的作用机制及临床推广仍需进一步研究探讨。