DNA倍体定量分析结合P16蛋白在宫颈癌筛查中的意义

韩 笑,朱 平,卓 倩,李 军,许 研

(淮安市肿瘤医院 淮安市淮安医院 1.病理科,江苏 淮安 223200;2.内分泌科)

宫颈癌在世界范围内癌症发病率中排名第三,在发展中国家中是女性最常见的癌症[1],是我国女性恶性肿瘤第二大死亡原因,严重威胁着女性生命健康。在我国中晚期宫颈癌的5年生存率平均为59.8%,如果癌症扩散到身体的远处,5年生存率仅为17%,但如果能早期发现,干预治疗及时,5年生存率可以达到90%以上[2]。并且随着社会发展,宫颈癌的发病年龄逐步年轻化,所以“早发现、早诊断、早治疗”在宫颈癌中尤为重要。本文通过对宫颈细胞DNA倍体定量分析进行初筛,结合宫颈活检病理组织学检查及P16免疫组织化学染色检查,旨在为宫颈癌早期发现提供有意义的初筛方法。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2020年3月～2021年3月淮安市肿瘤医院的门诊及住院患者,进行宫颈细胞DNA倍体分析检查4 334例为研究对象,年龄19～74岁,平均46.5岁。所有患者均在知情同意情况下进行,并通过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1宫颈细胞DNA倍体定量分析:宫颈取材患者采取截石位,用无菌棉球拭去宫颈口分泌物,使用宫颈取样刷沿宫颈管顺时针旋转5圈以上,然后将刷头放入细胞保存液瓶中。将放有刷头的细胞保存液送至本院病理科,由本院病理科技术人员将标本瓶放到振荡器上,振荡5～10 s。然后离心制片经Feulgen染色后,由全自动高分辨率细胞DNA图像定量分析Motic系统进行扫描分析筛选,细胞核DI(DNA index)值≥2.5为倍体异常。

1.2.2活检组织病理学检查:阴道镜下对倍体细胞数≥3个的女性进行宫颈活组织检查,送至本院病理科,用4%的中性甲醛固定4～6 h后,由病理科诊断人员对送检标本取材,后放入全自动脱水机进行脱水、浸蜡,病理科技术人员对浸蜡后组织进行包埋、切片、脱蜡、染色等步骤后制成组织HE切片,由具有高级职称的病理科诊断医师阅片、判读、发出病理诊断报告。

1.2.3免疫组织化学染色:病理技术人员将包埋好的组织蜡块连续切片2张,厚度为3 μm,免疫组织化学染色采用SP法检测P16蛋白的表达。免疫组织化学染色按试剂盒说明进行,用PBS缓冲液作为一抗,作为阴性对照;用已知的阳性片作为阳性对照。P16抗体、SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司。由具有高级职称的病理科诊断医师阅片、判读,发出报告。

1.3结果判定

1.3.1DNA倍体异常细胞:0个:未见DNA倍体异常细胞,定期复查;1～2个:可见少量DNA倍体异常细胞,4～6个月复查;≥3个:可见DNA倍体异常细胞,临床阴道镜检查及活体组织检查。有病理科医师将假阳性细胞进行去伪存真,保留真异常细胞。

1.3.2宫颈活检组织病理学检查:分为宫颈慢性炎(见挖空细胞、伴储备细胞增生和或腺体鳞化)、宫颈上皮内瘤变(CIN1、CIN2、CIN3)或伴累及腺体、宫颈癌(鳞状细胞癌和腺癌)。

1.3.3P16蛋白表达:于细胞核和(或)细胞质。光学显微镜下细胞核或者细胞质里呈现棕黄色颗粒,根据着色程度分别计0分、1分、2分、3分。阳性细胞<10%计0分,10%～25%计1分,25%～50%计2分,>50%计3分。综合判定取着色强度和阳性细胞百分数分值之积:0分为阴性,计为(-);1分以上为阳性,其中1分、2分计为(+),3分、4分计为(),6～9分计为()。“+～”均记作阳性(+)。所有切片由本院病理科具有高级职称病理诊断医师进行阅片、判读。

1.4统计学方法:采用SPSS17.0统计学软件进行χ2检验。

2 结果

检测分析4 334例中发现异常细胞1～2个有140例,异常细胞≥3个有202例。202例进行宫颈活检病理组织学(图1)发现150例为CIN1以上,同时对活检202例进行P16蛋白染色(图2)发现随着病变级别增高,P16表达百分比也随之上升,通过χ2检验发现P16蛋白在宫颈上皮内瘤变中表达有明显统计学意义(χ2=8.889,P=0.003)。见表1。

表1 DNA倍体异常细胞≥3个宫颈活检组织学与P16染色结果(n)

图1 宫颈活检病理组织学(HE,×400)

图2 P16在宫颈活检组织中的表达(DAB,×400)

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤,我国每年新增宫颈癌约13.15万例,占世界宫颈癌新发总数的1/3[3],而且死亡率居高不下。宫颈癌的治疗方法包括手术切除、放化疗等,对于中晚期患者不建议手术治疗;早期患者,结合患者情况采取手术切除,辅以放化疗;对于癌前期病变即CIN,可以结合患者情况行宫颈锥切或子宫全切。早发现、早治疗,可以大大提高患者的生存质量及生存率,所以宫颈癌的预防及早期发现尤为重要。宫颈癌的成功预防、诊断和临床管理在很大程度上依赖于早期筛查[4]。细胞学检查是较常用、创伤小、方便快捷的检查方法。相比其他细胞学筛查,宫颈细胞DNA倍体定量分析有其特有的优势,如智能分析、结果客观、灵敏度和特异性高等。

在生理情况下,DNA的复制是处于相对静止的状态,含量相对稳定。当细胞受到致癌因素的作用,处于增殖甚至异常增殖时,DNA的含量甚至结构都会发生改变。DNA含量的变化可以作为肿瘤细胞异常增殖的一项重要的生物学指标,鉴于癌变或者有癌变倾向的细胞内核酸含量会发生异常增生,且核酸含量的变化早于细胞形态的变化,所以DNA倍体定量分析技术被发明及广泛应用于宫颈癌早期筛查[5]。

宫颈细胞DNA倍体定量分析主要是通过对细胞核内DNA含量的测定,来判断细胞的生理状态、病理改变[6]。对细胞进行特殊染色,细胞核DNA着色后,细胞核染色强度与其含量会成正比,利用全自动DNA图像分析系统可以分析每个细胞核内DNA的积分光密度值(IOD),检测其含量的变化,且按细胞DNA含量由高到低自动排序,将核酸含量DI值≥2.5的用红色字体标记,方便识别,并用DNA直方图、散点图来显示标本的恶性程度。细胞的恶变首先会出现染色质的改变,出现异倍体细胞核,如不及时干扰最终发生癌变[7],宫颈细胞也不例外,当发生病变时,首先会产生非整倍体细胞,即异倍体细胞,从而被系统识别。DNA倍体定量分析技术是基于以上理论基础,所以该项技术在发现宫颈CIN方面要较常规细胞学检查更为灵敏。本研究中发现的202例异常倍体细胞≥3个,活检病理组织学证实有150例为CIN1以上,阳性率达74%,相对于其他宫颈细胞学检查阳性率要高。宫颈细胞DNA倍体定量分析技术由于快速、准确、客观、创伤小等优点,可以作为宫颈癌筛查的有效方法。

P16又叫MTS基因,是美国科学家Kamb等发现的抗癌基因,位于人类染色体9p21上,是细胞增殖的负调控因子,其所表达的P16蛋白是一种肿瘤抑制蛋白,可以直接参与细胞周期的调控,被喻为细胞周期中的刹车装置,一旦P16这个刹车装置失灵,会引起细胞恶性增殖,导致癌症的发生。P16蛋白表达的改变与肿瘤的发生发展有关[8]。在正常细胞中的表达较低,而当细胞增殖失控时,P16蛋白表达被激活,抑制细胞增殖[9]。P16蛋白激活后会结合细胞周期蛋白依赖性激酶4/6 (CDK4/6),抑制细胞周期蛋白D1和CDK4/6的结合,进而阻止视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化,并最终将细胞增殖阻止在细胞周期的G1期,从而减缓细胞生长[10]。Peter等[11-12]发现P16蛋白的异常表达与胰腺癌、食管癌、肺癌等关系密切。本研究结果显示P16蛋白的表达随着CIN级别的增高其表达亦增高。

当宫颈发生病变时,CIN的演变是不可预测的[13]。对生物标志物的分析可能有助于确定病变的进展或消退,而P16蛋白的免疫染色表达是被证实有用的,尤其对于宫颈高级别病变的诊断,意义更大[14]。陈春丽等[15]已经证实P16蛋白在宫颈癌筛查中有意义。LAST指南也推荐了组织学判读后四种需要应用P16染色检查的情况,其中对CIN1、CIN2、CIN3,尤其是病理专家考虑到CIN2诊断时,推荐使用P16免疫组化染色辅助判读;而当细胞学判读结果和病理组织学不一致,细胞学诊断为高度鳞状上皮内病变(HSIL)、意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)等,活检标本组织学被诊断为CIN1及以下病变,也推荐使用P16免疫组化染色检测作为一种辅助的形态学评估指标。

宫颈癌筛查的目的是发现CIN1以上病变,能够及时干预治疗。理想的宫颈癌筛查手段应该是在提高细胞学检测敏感性的同时,能够不损失其特异性,或者可以通过客观的生物标志物,标记出高级别病变的细胞,以辅助细胞学检测结果的判读和诊断。本文正是通过细胞DNA倍体定量分析筛查出阳性病例,活检后组织病理学检查与P16蛋白免疫染色结合起来,旨在提高检出率,为宫颈癌筛查提供更有意义的方法,为宫颈癌的早期发现提供更多的思路。