双氢青蒿素对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞分泌胶原及激活PI3K/AKT通路的影响

张素华,栗志英*,蔡安盛,姚晓华,杜相珠,行红燕,郭永泽,马景红

(1.河北工程大学附属医院,河北 邯郸056002;2.邯郸市第一医院,河北 邯郸056002)

心肌纤维化常由于心脏多次短暂缺血、负荷过重、心肌炎等多种有害因素所致。研究显示心肌组织中的胶原异常沉积为心肌纤维化病理学特征[1-2],引起心肌硬度增加、收缩能力下降,易发生心律失常、心室重构以及心功能不全等并发症。心肌成纤维细胞数量增多和异常活化释放大量基质成分为心肌纤维化的重要机制,也是疾病治疗的关键点[3-4]。实验表明血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是促进心肌发生纤维化的重要因子[5-6]。本研究采用AngⅡ孵育心肌成纤维细胞制备细胞模型,经双氢青蒿素(DHA)干预后,分析细胞的数目及分泌胶原含量的变化,探究DHA抗心肌纤维化的作用机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及药品

乳鼠:SD种属,1～3 d,购自郑州大学医学部动物研究所。

药品:AngII 购于上海源叶生物公司;DHA 购于西安展迅生物公司;波形蛋白,Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白,α-SMA,p-PI3K,p-AKT的第一抗体购于Invitrogen公司;羟脯氨酸检测试剂盒均购于艾迪抗生物公司。

1.2 方法

1.2.1获取心肌成纤维细胞 取12只出生第2 d的SD大鼠,麻醉并用酒精消毒后,无菌条件下摘取心脏,剪下心室放置于冰浴的孵育液中,清洗并剪成细小组织块,胰酶消化、过滤后的滤液置于离心机(D=12 cm)里离心获得细胞,然后用孵育液培养,利用不同细胞差时贴壁的特点,纯化成纤维细胞,孵育2 d时鉴别细胞类型和形态观察。

1.2.2细胞分组 成纤维细胞等量分为:正常组、DHA组、AngⅡ组和DHA+AngⅡ组。正常组:仅有孵育液;AngⅡ组:孵育液中有AngⅡ(10-6mol/L);DHA组:孵育液中有DHA(100 ng/mL);DHA+AngⅡ组:孵育液中有Ang(10-6mol/L)Ⅱ和DHA(100 ng/mL)。

1.2.3细胞增殖的检测 将细胞用孵育液调配为5×104个/ml,移植到96孔培养板中,每孔均为200 μl,孵育24 h时细胞生长为同步化状态,每组细胞均重复安排6个孔,孵育48 h后,滴加噻唑蓝染液20 μl,孵育4 h。清除各孔溶液,加二甲基亚砜,震荡几分钟后于适当长度波下读取每孔的吸光度值。

1.2.4孵育液中羟脯氨酸含量的检测 提前备好3个管,分别放入等量的三蒸水、标准液体及细胞孵育24 h后的悬浮液,各管中滴加适量的消化液,37℃反应3 h。依次按照试剂盒的说明步骤加入试剂1、2、3,最后离心获得上清液放入比色杯中,于分光光度计中检测吸光值。

1.2.5胞质内ColⅠ、Col Ⅲ蛋白的检测 各组细胞均孵育2 d后,获取胞质内的所有蛋白,80 μg变性蛋白移入凝胶孔里,电泳分离目的蛋白后,印迹到薄膜上,薄膜浸入封闭液中1 h,再浸入第一抗体ColⅠ(1∶800)、Col Ⅲ(1∶600)、α-SMA(1∶500)、p-PI3K(1∶600)、p-AKT(1∶800)稀释液中,4℃反应过夜,第二天移至第二抗体(1∶1 000)稀释液中反应2 h,3次洗膜后于暗室中进行化学发光实验,把蛋白条带显影并定影于X光片上,晾干后分析胶片上的光密度值。

2 结果

2.1 观察细胞的形态结构与性质鉴定经1.2.1方法所得的细胞纯度大于90%,培养瓶中的细胞在镜下可见:细胞贴壁生长,第3天时可见细胞体积变大,从胞体伸出长短、粗细不等突起,单个圆形核,位于细胞中央。经免疫细胞化学法染色见细胞内的波形蛋白染为棕黄色,见图1。

图1 上皮细胞的形态结构与性质鉴定(×400)

2.2 细胞增殖实验结果细胞的吸光度值能反映其增殖情况,DHA组与正常组之间无明显差异(P>0.05),AngⅡ组比正常组升高(P<0.05);DHA+AngⅡ组比AngⅡ降低(P<0.05),见表1。

表1 各组细胞增殖及羟脯氨酸实验结果分析

2.3 细胞悬浮液中羟脯氨酸的检测结果用悬浮液的吸光值评估其中羟脯氨酸的含量,DHA组与正常组之间无明显差异(P>0.05),AngⅡ组比正常组升高(P<0.05);DHA+AngⅡ组比AngⅡ降低(P<0.05),见表1。

2.4 胞质内指定蛋白的检测结果蛋白条带的相对灰度值评估ColⅠ、Col Ⅲ、α-SMA、p-PI3K、p-AKT的含量,DHA组与正常组之间无明显差异(P>0.05),AngⅡ组比正常组升高(P<0.05);DHA+AngⅡ组比AngⅡ降低(P<0.05),见图2、表2。

表2 胞质内ColⅠ和Col Ⅲ蛋白灰度值的分析

图2 胞质内ColⅠ、Col Ⅲ等蛋白灰度条带的显示

3 讨论

心肌纤维化是发展为心功能障碍的主要心脏疾病之一,心肌细胞在缺血、炎症等多种有害因素的作用下受到损伤时,其自身不能再生,主要依靠间质细胞分泌大量基质成分的方式进行修复,其显著的病理学特征表现为心肌细胞之间有大量的胶原蛋白异常聚集[7-8]。间质细胞中的成员之一成纤维细胞,在此修复过程中扮演着重要的角色。在有害信号的刺激下,成纤维细胞转分化为间充质性质的细胞,增殖分裂能力增强,释放大量的以胶原为主的基质成分,从而使心肌间质里出现纤维化病理改变[9-10]。

研究显示,Ang II作用于心肌间质中的成纤维细胞,使其转分化为具有a-SMA表型分子的间充质细胞,分裂出大量的细胞,向细胞外释放大量的胶原蛋白,其中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白占较大比例,同时合成多种致纤维化因子如TGF-β1等,促进了心肌纤维化的发展[11-13]。本研究结果表明,AngⅡ作用于成纤维细胞后,其数量增多,细胞表型分子a-SMA的含量增加,释放到悬浮液中的羟脯氨酸(胶原分子的主要成分)含量升高,同时胞质内合成的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量也增加。

QIN等[14]报道PI3K/AKT信号通路在调节心肌细胞纤维化发生、发展的过程中起着十分重要的作用,此信号通路能通过调节细胞自噬、凋亡、生长以及一系列分子转录相关基因来影响心肌纤维化的进程。NIE等[15]实验研究显示,利用阿霉素建立大鼠心肌纤维化模型,经过硫化氢干预后,通过增强 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的表达来调节自噬达到改善心肌纤维化的作用。赵研等[16]采用Ang II制备的大鼠原代心肌细胞纤维化模型中PI3K/AKT信号通路被活化,导致a-SMA的含量增加和大量胶原蛋白的产生,二参真武汤能明显抑制此通路的活性并有效改善心肌细胞的纤维化程度。

双氢青蒿素是中草药青蒿素的衍生物之一,除了具有抗疟功效外,它还能发挥拮抗肿瘤、降低炎症、增强免疫等生物学作用[17]。在肝脏组织纤维化的实验小鼠采用适量的双氢青蒿素治疗一段时间后,组织中的纤维化病变得到了改善,肝功能也较治疗前增强[18]。宋玉杰等[19]体外实验中,TGF-β1刺激子宫内膜的间质细胞,发现其增殖能力和活性均增强,经双氢青蒿素干预后,此种效应减弱。本实验数据揭示,双氢青蒿素能通过降低PI3K/AKT通路的活性抑制AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞增殖、分化和分泌胶原的含量,从而达到改善心肌纤维化的作用。