水分含量对红豆草青贮发酵品质的影响

2024-04-24王虎成沈禹颖

草业科学 2024年3期

吴璞，王虎成，沈禹颖

（兰州大学草地农业科技学院, 甘肃兰州 730020）

红豆草(Onobrychis viciaefolia)又名驴食豆，为豆科红豆草属多年生深根型牧草，具有耐干旱、耐贫瘠、生长快、产量高等优良生物学特性[1]。其不仅营养价值丰富，且含有缩合单宁，反刍动物食之不易导致瘤胃臌胀，同时还能减少消化道中的寄生虫，提高机体对营养物质的消化率，故享有“牧草皇后”之美称[2]。由于红豆草具有较强的生态适应性，已在我国西北、华北和西南等地区得到了广泛的推广种植[3]。但在我国红豆草主产区，由于雨热同期，调制干草易受淋雨、落叶等因素的影响，因此选择可替代的饲草调制贮藏技术可为合理利用该饲草资源提供新的途径[4]。与干草相比，青贮可以有效保存新鲜牧草中的营养成分，味道酸香柔软，在提高饲料适口性和家畜采食量的同时，还可为冬季妊娠、哺乳期母畜提供青绿多汁的粗饲料[5]。在青贮饲料调制过程中，适宜的含水量是保证青贮过程中乳酸菌正常活动的重要条件，也是决定青贮发酵品质的关键因素。当青贮原料含水量较高时，青贮过程中大量营养物质易随渗出液流失，同时导致梭菌等不良微生物快速繁殖，释放出难闻的丁酸、氨态氮气味[6]。当青贮原料含水量过低时，不仅不利于压实引起好氧霉变[7]，还会使青贮介质中水的活性降低，进而限制发酵过程中乳酸菌的增殖[8-9]，导致青贮pH 偏高，难以抑制有害微生物的繁殖。因此，调制青贮时要综合考虑青贮原料特性与其水分含量之间的关系。不同的青贮原料其青贮最适水分含量亦会产生差异。覃方锉等[10]研究了含水量对灌浆期燕麦(Avena sativa)青贮发酵品质的影响，结果发现燕麦含水量在65%～70%时青贮品质最优。刘辉等[11]研究发现紫花苜蓿(Medicago sativa)原料含水量为61.8%时，其青贮发酵品质要优于含水量为72.6%时。而孙合美等[12]在不同含水量对发酵饲料中乳酸菌活菌数的影响试验中发现只有水分含量在30%～40%时，水分含量越高，乳酸菌活菌数则升高越快。一般而言，豆科牧草的干物质含量低，粗蛋白含量高，可溶性碳水化合物低，缓冲能高，直接青贮难以成功[13]。生产实践中常采用田间凋萎的方法使豆科牧草中水分含量为 45%～55%从而进行半干青贮的调制，但田间凋萎过程中牧草含水量易受当地气候状况的影响，且随着萎蔫时间的延长，水溶性碳水化合物和易被水解的蛋白质也会随之大量损失[11]。因此，针对豆科牧草青贮问题，研究高水分条件下青贮的可行性十分必要。目前，国内外关于水分含量对于不同品种牧草青贮品质的影响报道较多，但对于红豆草裹包青贮的适宜水分含量研究鲜见报道。因此，本研究以陇中地区广泛种植的红豆草为原料，探讨不同水分含量对其青贮发酵品质的影响，以期筛选出红豆草最适青贮含水量，探索红豆草作为青贮原料在不使用添加剂进行青贮时的可行性，为调制品质优良的红豆草青贮提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

红豆草青贮原料采自甘肃省定西市鸿壮农牧有限公司红豆草种植样地(35°35′ N， 103°52′ E)。该地区位于黄土高原丘陵沟壑区，海拔2 390 m，温带大陆性气候特点显著。年均气温7.2 ℃，极端高温35.1 ℃，极端低温-29.7 ℃。年降水量 350～600 mm，主要集中在7 月、8 月和9 月。年蒸发量1 536 mm，相对湿度64%，年日照时数25 002 h，年无霜期140 d。红豆草草地建植于2016 年，采用条播方式，行距30 cm，播种深度3～4 cm。

1.2 试验材料

2019 年8 月中旬，于盛花期刈割二茬红豆草用于青贮调制。在红豆草种植样地按照对角线取样法，在5 个不同取样点刈割取样。将刈割后的样品混合均匀，取10 g 立即保存于灭菌离心管中，用于原料草表面微生物的测定。剩余样品带回实验室，取部分试验材料于65 ℃烘箱(101-2B，Subo，中国)中烘干，测定其初水分后用微型植物样粉碎机(BJ-800A，Baijie，中国)粉碎，用于青贮原料常规营养成分的测定。

1.3 试验设计

将刈割的二茬红豆草(水分含量为60%)设为对照组，在对照组的基础上添加一定量的无菌水，使其水分含量达到65%、70%和75%共3 个水平，每组均设置6 个重复。

1.4 青贮调制

使用微型喷雾器(SR-2108G，SUN-RAIN，中国)在红豆草原料上喷洒无菌水使其水分达到预设值，搅拌均匀后称取450 g 青贮原料，装入25 cm × 35 cm聚乙烯袋中，用真空包装机抽气密封，并在外层用真空袋进行两次密封，然后将青贮袋置于避光处，室温贮藏60 d。

1.5 指标测定及方法

感官评定：依照德国农业协会(Deutche Landwirtschafts Gesellschaft，DLG)评分法对青贮饲料的气味、结构及色泽打分[14]。评分标准分为4 个等级，分别为1 级优等、2 级尚好、3 级中等和4 级腐败。得分为16～20 分青贮品质评价为1 级，得分在10～15 分青贮品质评价为2 级，得分为5～9 分青贮品质评价为3 级，0～4 分则为4 级。

发酵品质测定：青贮60 d 后，取出全部青贮样品并混合均匀，称取20 g 青贮料样品，置于250 mL烧杯中，加入180 mL 蒸馏水搅拌，放入4 ℃冰箱中浸提24 h，中途每4 h 搅拌一次，然后经定性滤纸过滤，得到青贮发酵浸提液，立即用pH 计(pHSJ-3F)测定其pH[13]。参照Broderick 和Kang[15]的方法采用苯酚-次氯酸钠比色法测定青贮饲料氨态氮(NH3-N)含量，并以总氮基础表示。乳酸(lactic acid, LA)通过乳酸试剂盒(A019-2-1, Jiancheng, 南京)进行测定；乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid,PA)和丁酸(butyric acid, BA)参考姜芳等[16]的方法采用气相色谱仪(Agilent, Hewlett Packard，美国)进行检测，配置氢气火焰离子化检测器(FID)，色谱柱为30 mm × 0.32 mm × 0.33 μm (DB-FFAP，Agilent Technologies 公司，美国)，汽化室温度为200 ℃，检测器温度为250 ℃，载气为高纯氮气(20 mL·min-1)，分流比为50 ∶ 1，进样器为1.0 μL。

营养成分测定：将青贮饲料样品用冷冻干燥机(SR-A10N-50，Sheyan，中国)持续冷冻48 h 左右，直至重量不再变化，此时测定样品的初水分(moisture,Moi)含量。将冻干后的样品用微型植物样粉碎机进行粉碎，测定其常规化学成分。粗蛋白(crude protein, CP)含量采用凯式定氮法测定[17]，中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)根据Van Soest 等[18]的方法测定，利用索氏浸提取法测定饲料中粗脂肪(ether extract，EE)含量[17]，通过高温灼烧法测定粗灰分(Ash)含量[17]，水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)采用蒽酮-硫酸比色法测定[19]。

微生物计数：微生物主要测定乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、大肠杆菌(Enterobacteriacea)、酵母菌(Yeast)和霉菌(Mold)的数量。取新鲜青贮饲料样品20 g 加入180 mL 灭菌生理盐水(0.85% NaCl)，于恒温摇床以250 r·min-1摇速摇动2 h。LAB 采用MRS培养基在37 ℃下厌氧培养48 h，Yeast 和Mold 采用马铃薯葡萄糖培养基28 ℃培养5 d，Enterobacteriacea采用结晶紫中性红胆盐琼脂在37 ℃有氧条件下培养24 h。所有种类微生物培养结束后进行平板计数，并折算微生物数量[20]。

1.6 数据分析

采用SPSS 23 软件进行单因素方差分析(ANOVA)，若组间差异显著，使用Duncan’s 法进行多重比较，以P＜ 0.05 为差异显著性判断标准。通过SPSS 软件进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，计算方差矩阵的特征值、特征向量及主成分累积的方差贡献率，根据特征向量建立主成分方程式，按照各主成分的权重系数求出主成分的综合得分。

2 结果

2.1 青贮原料化学成分及微生物组成

红豆草青贮原料干物质(dry matter，DM)、CP、NDF、ADF、EE、Ash 和WSC 含量分别达到了40.47%、16.23%、61.43%、41.66%、10.59%、6.96%和13.31%(表1)。红豆草原料表面所附着的乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌数量分别为4.67、5.71、2.72 和2.95 lg cfu·g-1。

表1 红豆草青贮原料化学成分及微生物组成Table 1 Chemical and microbial composition of sainfoin before silage

2.2 不同水分含量红豆草青贮感官评分

60%和65%水分含量的红豆草青贮感官评价得分分别为16 和20，等级均为1 级优等(表2)；70%和75%水分含量的红豆草青贮感官评价得分分别为13 和5，等级为2 级尚好和3 级中等。

表2 不同水分含量红豆草青贮感官评分Table 2 Sensory score of sainfoin silage of varying moisture content

2.3 水分含量对红豆草青贮发酵品质的影响

水分含量对红豆草青贮pH、LA 和BA 均存在显著影响(P＜ 0.05) (表3)，其中，水分含量为70%的青贮组pH 显著高于水分含量为60%和75%的青贮组；水分含量为75%的青贮组中LA 含量显著高于水分含量为60%和70%的青贮组(P= 0.01)，与水分含量为65%的青贮组无显著差异；70%水分含量的青贮组其BA 含量显著高于60%和65%青贮组(P= 0.04)；不同水分处理对红豆草青贮中AA 和PA 含量无显著影响(P＞ 0.05)。

表3 水分含量对红豆草青贮发酵品质的影响Table 3 Effect of moisture content on fermentation quality of sainfoin silage

2.4 水分含量对红豆草青贮营养成分的影响

水分含量对红豆草青贮CP、WSC 和Ash 含量影响显著(P ＜0.05) (表4)，其中65%水分含量的青贮组其CP (P= 0.001)和WSC (P= 0.003)含量显著高于其他3 组，分别达到了15.31%和12.00%；水分含量为60%的青贮组其Ash 含量显著低于其他3 组(P= 0.01)；不同水分处理对红豆草青贮中EE、NDF、ADF 含量均无显著影响(P＞ 0.05)。

表4 水分含量对红豆草青贮营养成分和微生物数量的影响Table 4 Effect of moisture content on chemical composition of sainfoin silage

2.5 水分含量对红豆草青贮微生物数量的影响

水分含量对红豆草青贮中LAB 数量影响显著(P= 0.02) (表4)，65%水分量的红豆草青贮其LAB含量显著高于70%和75%处理组，达到了5.85 lg cfu·g-1；水分含量对红豆草青贮酵母菌含量未产生显著影响(P＞ 0.05)；大肠杆菌在各处理中均未检测出；霉菌只在水分含量为70%的青贮组中检测出，其含量为2.03 lg cfu·g-1。

2.6 不同水分含量红豆草青贮品质综合评价

利用Kaiser-Meyer-Olkin 检验剔除相关性指标，最终从24 个青贮样品中筛选出发酵品质指标(pH、NH3-N/TN、LA、PA、BA)、营养成分指标(CP、ADF、NDF、WSC)、微生物指标(LAB)进行主成分分析，特征值和方差贡献率如表5 所列。前3 个主成分特征值≥1，累积贡献率已达到78.66%，即保留了原有指标78.66%的信息。

表5 主成分的特征值和贡献率Table 5 Characteristic values and contribution rates of principal components

主成分对应的特征向量和载荷矩阵表明，第1 主成分在X1(CP)、X2(LA)、X3(NH3-N/TN)、X4(WSC)和X5(LAB)上载荷值较大(表6)，其权重系数分别为0.78、-0.75、-0.62、0.61 和0.53；第2 主成分在X6(BA)、X7(pH)、X8(PA)和X9(ADF)上载荷值较大，权重系数依次为0.76、0.69、0.61 和- 0.59；第3 主成分在X8(PA)和X10(NDF)上载荷值较大，权重系数为0.56 和-0.50。通过前3 个主成分的特征向量矩阵，得出每个主成分综合得分线性方程，以每个主成分对应的方差相对贡献率作为权重建立综合评价模型：

表6 主成分对应的特征向量及载荷矩阵Table 6 Eigenvectors and load matrix corresponding to the principal components

通过上述模型计算不同水分含量红豆草的综合得分并进行排名(表7)。第1 主成分中，得分较高的是水分含量为65%和60%的青贮组；第2 主成分中，得分较高的是水分含量为70%和65%的青贮组；第3 主成分中，得分较高的是水分含量为60%和65%的青贮组；3 个主成分的综合得分排名依次为水分含量为65%的青贮组、60%的青贮组、70%的青贮组和75%的青贮组。

表7 不同水分含量红豆草青贮的主成分得分Table 7 Principal component scores of sainfoin silage with different water content

3 讨论

感官评定是青贮发酵品质最常用的方法，通常依靠评定者的视觉、嗅觉、触觉和味觉对青贮饲料品质进行粗略评估，因其方便快捷，在生产中被广泛使用[21]。一般情况下，品质优良的青贮饲料气味酸香温和，色泽多呈绿色或黄绿色，质地柔软湿润，可以清楚地看到植物完整的茎叶结构。品质中等的青贮饲料，芳香味较弱，酸味中略带酒味，色泽呈黄褐色或暗绿色，茎叶结构保持不是很完整，这种青贮饲料往往不能够饲喂妊娠家畜。劣质的青贮饲料具有强烈的发霉气味，色泽为棕色或黑色，触感湿而粘腻，或干而粗糙。本研究采用德国农业协会(DLG)评分法对不同水分含量红豆草青贮进行感官评价，结果表明60%和65%水分含量的红豆草青贮感官评价得分等级均为1 级优等，其气味酸香、茎叶结构清晰可见、颜色呈黄绿色。而水分含量为70%的红豆草青贮感官评价得分等级分别为2 级尚好，其气味柔和，酸香中略带酒香、茎叶结构保存良好、颜色呈黄褐色。但水分含量为75%的红豆草青贮感官评分为3 级中等，其气味刺鼻、茎叶结构保存较差、颜色呈深褐色。感官评定试验结果初步表明红豆草低水分青贮组发酵品质高于高水分青贮组。

青贮pH、LA、AA、PA 和BA 的浓度是评定青贮发酵品质的重要指标，青贮发酵品质好坏往往可通过青贮的pH 和有机酸含量来反映。当青贮pH大于4.5，被认为是发酵失败的标志之一，当青贮pH 小于4.2 时，青贮中的有害微生物能够被有效抑制，蛋白质不易降解产生有毒、有害物质，进而使发酵过程中干物质的损耗降低[22]。本研究中，水分含量为60%、75%的红豆草青贮pH 显著低于70%水分含量青贮组，但各水分处理下的红豆草青贮pH 都超过了4.2。一般而言，豆科牧草粗蛋白含量较高、可溶性碳水化合物含量低，可用于发酵的底物较少，所以青贮后饲料的pH 较高，但本研究中所选用的红豆草水溶性碳水化合物高达13.31%，因此其青贮pH 偏高可能并不是由碳水化合物含量较低造成。此外，Oliveira[23]通过Meta 分析发现当新鲜牧草表面乳酸菌附着量超过5 log10cfu·g-1时能够为发酵提供足够的微生物启动因子，从而保证青贮的品质。而本研究所选用的红豆草原料表面所附着的乳酸菌含量只达到4.67 lg cfu·g-1，这可能使青贮发酵过程中乳酸菌的发酵动力不足，从而导致其pH 偏高。在青贮过程中，NH3-N/TN 能够反映出牧草中蛋白质的降解程度，NH3-N/TN 降低，表明饲料中的蛋白降解被抑制[24]。在本研究中，65%水分含量的红豆草青贮组NH3-N/TN 有低于水分含量为70%和75%的青贮组的趋势，说明相对于其他处理条件，65%的含水量能够使红豆草青贮中蛋白降解程度降低。青贮中的有机酸可以提供酸性环境，有效地抑制微生物的生长和繁殖，从而减少青贮饲料的损耗和变质[25]。青贮过程中微生物可以利用碳水化合物并生成LA，LA 含量的提升则会利于青贮pH 的降低，进而能够使有害菌被抑制。在本研究中，65%和75%水分含量均能够有效提高红豆草青贮中LA 的含量。究其原因可能是由于在该水分条件下附着在红豆草表面的野生乳酸菌活性较高，能够在发酵系统中迅速繁殖占据主导地位，进而加速青贮发酵的进程。AA 在青贮有氧暴露阶段能够起到抗真菌的作用，尤其是对于酵母菌等不耐酸真菌，能够有效避免青贮二次发酵，使青贮饲料的有氧稳定性延长[26]。在本研究中，不同含水量对青贮AA 含量无显著影响，但水分含量为75%的青贮组其AA 含量较其他处理组低，这可能是由于该处理条件下乳酸菌含量增多对醋酸菌的生长繁殖产生了营养竞争性抑制所导致。青贮过程中有机酸的组成及含量是评价青贮品质优劣的重要指标，但在不同的青贮品质评价体系中，LA 及AA 含量的高低对青贮品质的贡献依旧存在争议，过去大多数学者认为LA 是评价青贮品质的主要指标[6]。但目前的许多研究认为LA 是青贮中酵母菌和霉菌主要的营养物质来源，当青贮开封后，乳酸含量过高易导致酵母菌迅速繁殖造成二次发酵[23]。丁酸是梭菌等不良微生物将青贮中已生成的乳酸或原料中的可溶性糖分解而形成，同时伴随着能量的损失和蛋白质的分解，并生成大量的胺或氨，使青贮饲料变臭，降低青贮品质及动物采食量[6]。在本研究条件下，各处理组都产生了一定量的丁酸，70%水分含量的红豆草青贮中丁酸含量显著高于60%和65%水分含量青贮组。

营养成分反映了青贮过程中养分损失的程度，是青贮品质评价的关键[27]。本研究中，水分含量为65%的青贮组其CP 含量显著高于其他3 组，且与红豆草原料中CP 含量最接近，说明该处理条件下青贮发酵过程中CP 降解量少，与本研究中NH3-N/TN 指标变化趋势相反。究其原因可能是65%水分含量下，青贮过程中以可溶性碳水化合物为养分的乳酸菌活动旺盛，进而对其他分解CP 的有害微生物产生了营养竞争性抑制[28]。此外，在青贮开袋后对其表面附着的乳酸菌计数发现，水分含量为65%的青贮组其乳酸菌的数量也显著高于其他3 组。优质青贮饲料一般具有较高的CP 含量和较低NDF 和ADF 含量[29]。在本研究中，不同水分处理对豆科牧草中ADF 含量无显著影响，但60%水分含量的红豆草青贮其NDF 含量有低于其他处理组的趋势。这可能是由于在60%和65%水分条件下，青贮中乳酸菌的数量较高，在短时间内乳酸菌利用发酵底物产生大量微生物酶，使植物细胞壁结构变的松散[30]，微生物与其接触面积增大，进而促进了纤维组分的降解。

通过对比多项单一指标，不同水分含量的青贮品质均存在优劣，难以筛选出适合红豆草青贮的最适水分，需要建立合理的整体评价体系。目前，对于青贮发酵品质的评定通常以发酵指标(LA、AA、BA)或营养成分的降解程度(NH3-N/TN)来评定，这样的评定方式没有考虑到青贮的二次发酵，以及牧草原料本身的营养成分差异所导致的发酵参数的改变，其评价结果不具备客观性[6]。也有研究者采用V-Score、隶属函数等方法进行综合评价[31-33]。但在评估中，各个指标对其青贮质量的评估重要性不同，而各个指标的权重分配将会对最后的评价结果产生影响。所以，利用上述评估手段对青贮品质进行评估是不全面的。而主成分分析可通过其方差贡献率确定各指标权重，并且能够利用少数几个新变量来反映原始变量的主要信息，所包含的信息量占原始信息的比例较大，具有较高的可信度[34]。本研究利用主成分分析方法将4 种不同水分处理的红豆草青贮饲料的多个指标综合为3 个独立因子，这3 个因子反映了原始变量信息的78.66%，得分从大到小依次为水分含量65%、60%、70%、75%的青贮组。