不同贮藏时间对紫花苜蓿干草营养品质和氨基酸的影响

珠 娜，王志军，郝百贺，赵牧其尔，包 健，意如乐，格根图

（内蒙古农业大学草原与资源环境学院 / 农业农村部饲草栽培、加工与高效利用重点实验室, 内蒙古 呼和浩特 010019）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种豆科植物，在世界范围内被广泛使用，具有很高的营养价值、易于消化。基于这些特性，被称为“牧草之王”[1]。与其他豆科植物相比，紫花苜蓿具有鲜明的优势，含有丰富的大量和微量营养物质以及维生素和氨基酸。随着畜牧业的发展和农业产业的重组，紫花苜蓿在全国耕种的土地面积逐年增加，在饲料产业的发展道路上发挥着非常重要的作用[2]。紫花苜蓿主要利用方式为初花期收获调制干草[3]。由于含水量低，苜蓿干草捆可以长期贮藏，为牲畜提供高质量饲料[4]。大量优质干草的准备和贮存是草食动物顺利度过冬春两季枯萎期及其健康生长发育的重要保证[5]。张培青[6]研究发现，随着贮藏时间的延长，干草捆的粗蛋白(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)、胡萝卜素、总可消化营养物质及相对饲喂价值(relative feeding value，RFV)降低，粗纤维(crude fiber，CF)含量升高。氨基酸参与调节物质的代谢和体内的信息传递，在生物体的生命活动中起着重要的作用。经过前人的大量研究和应用，氨基酸已被广泛应用于食品工业、农业、畜牧业及人体健康、保健等方面[7]。郝百贺等[8]研究发现，氨基酸作为评价苜蓿干草品质的指标具有显著作用。目前有关苜蓿干草的贮藏时间对营养品质影响的研究较多，但是结合氨基酸对苜蓿干草品质综合分析的研究较少。为此，研究不同贮藏期苜蓿干草营养物质含量的变化和氨基酸的动态变化特征，通过隶属函数分析方法对苜蓿干草营养品质及氨基酸进行综合评价，探讨苜蓿干草的最佳贮藏时间，以期为贮藏优质苜蓿干草提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于呼和浩特市赛罕区内蒙古农业大学试验地进行，试验地位于内蒙古自治区中部大青山南侧，地处40°36′～40°57′ N、110°40′～112°10′ E。该地属大陆性气候，属典型的温带气候。年均降水量335.2～534.6 mm，年均气温 6.7 ℃，无霜期 113～134 d。

1.2 试验设计

试验材料为紫花苜蓿‘Bara310SC’，于2020 年6 月1 日种植。试验材料生长第2 年进入初花期(2021 年6 月8 日)时收获，自然干燥至15%的水分含量后进行打捆。分别在贮藏30、60、90 和120 d时，用取样器从草捆中取500 g 样，3 个重复。

1.3 测定项目

采用全自动杜马斯定氮仪测定粗蛋白质含量[9]，采用 ANKOM2000I 型纤维分析仪测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和 酸 性 洗 涤 纤 维(acid detergent fiber，ADF)含量[10]，采用马弗炉550 ℃灰化法测定粗灰分(crude ash，Ash)含量[11]。

1.3.1氨基酸样品制备及计算

试验方法参考GB/T18246-2019[12]采用S-433D全自动氨基酸分析仪进行盐酸水解法；将45～50 mg苜蓿样品准确称量，置于安培管内，加入6 mol·L-1盐酸10 mL ，充入氮气30 s，密封后在110 ℃恒温干燥箱内水解24 h，冷却，过滤，定容至25 mL。取1 mL 在试管中，使用平行蒸发仪蒸干后加入5 mL柠檬酸钠缓冲溶液复溶，使氨基酸浓度适宜，振荡，混匀，0.22 μm 滤膜过滤装入1.5 mL 进样瓶中[13]。

根据联合国粮食与农业组织和世界卫生组织提出的氨基酸平衡理论，FAO/WHO 氨基酸模式进行蛋白质营养评价。通过先计算氨基酸比值(ratio amino acid, RAA)，再计算各氨基酸比值系数(ratio coefficient, RC)。以此为基础计算出氨基酸比值系数及 氨 基 酸 比 值 系 数 分(score ratio coefficient Amino acid, SRCAA)，SRCAA 表示待测蛋白质中必需氨基酸与参考蛋白模式中相应必需氨基酸的接近程度及在氨基酸平衡上所作的贡献。

氨基酸比值(RAA) = 待测蛋白质中氨基酸含量/模式氨基酸含量；

氨基酸比值系数(RC) = 氨基酸比值/氨基酸比值之均数；

氨基酸比值系数分(SRCAA) = 100 -CV× 100。式中：CV为RC的变异系数。CV= 标准差/均数，如果待测蛋白质的氨基酸组成与模式氨基酸一致，则CV= 0，SRCAA= 100。而当待测蛋白质的RC越分散，CV相应的变大，SRCAA变小，表示该蛋白质的营养价值越差[14-15]。

1.3.2 粗饲料相对饲喂价值(RFV)计算

利用干物质采食量(dry matter intake，DMI)和可消化干物质(digestible dry matter，DDM)对各处理的相对饲用价值进行评定并计算：

式中：DMI为饲料干物质采食量，单位为占体重的百分比(%)，BW(body weight)为可消化的干物质，单位为占干物质的百分比(%)[16]。

1.4 数据分析

利用Excel 2016 进行数据统计；利用SPSS 22对数据进行单因素方差及相关性分析。结果以平均值 ± 标 准 误 表 示，P＜ 0.05 表 示 差 异 显 著、P＜0.01 表示差异极显著。对不同贮藏期苜蓿干草的营养品质采用模糊数学中的隶属函数分析方法进行综合评价。

隶属函数计算公式：

反隶属函数计算公式：

式中：Xi为第i个指标测定值，Xmax和Xmin表示第i个指标的最大值和最小值，粗蛋白质、相对饲喂价值、总氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸和苜蓿干草营养品质正相关时，使用式(1)，酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、粗灰分与苜蓿干草营养品质负相关时，使用公式(2)[17]。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏时间对苜蓿干草营养品质的影响

2.1.1 不同贮藏时间对苜蓿干草CP 的影响

苜蓿干草在不同贮藏时间下CP 含量的变化(图1)表明，0～120 d 贮藏期间，苜蓿干草CP 含量随贮藏期延长而不断下降。贮藏0 d 时CP 含量为15.13%，贮藏30 d 后下降0.26%，贮藏120 d 后，CP 含量最低，为13.54%，较0 d 显著下降1.59% (P＜ 0.05)。贮藏30、60、90 d 的CP 含量无显著差异(P ＞0.05)。

图1 不同贮藏时间粗蛋白含量Figure 1 The crude protein (CP) content of alfalfa hay at different storage times

2.1.2 不同贮藏时间对苜蓿干草ADF 含量的影响

苜蓿干草ADF 含量在不同贮藏时间下的变化(图2)表明，在贮藏0～120 d 期间，苜蓿干草ADF含量无异常值，ADF 含量持续显著增加(P＜ 0.05)。

图2 不同贮藏时间ADF 含量Figure 2 The acid detergent fiber (ADF) content of alfalfa hay at different storage times

贮藏0 d 的ADF 含量为35.05%，贮藏30、60、90 d后 分 别增加1.42%、3.65%、7.03%，贮藏120 d 时ADF 含量上升趋势明显，含量为43.56%，较0 d 上升8.51%。

2.1.3 不同贮藏时间对苜蓿干草NDF 含量的影响

苜蓿干草NDF 含量在不同贮藏时间下的变化(图3)显示，在贮藏0～120 d，苜蓿干草NDF 含量无异常值。贮藏过程中NDF 含量持续升高。贮藏60 与90 d 含量差异不显著(P＞ 0.05)。

图3 不同贮藏时间NDF 含量Figure 3 The neutral detergent fiber (NDF) content of alfalfa hay at different storage times

贮藏0 d 的 NDF 含量为42.33%，经30 d 贮藏，NDF含 量 为47.92%，比0 d 增 加5.59%。贮 藏120 d 时NDF 含量增加趋势明显，与0 d 相比增加了10.98%。

2.1.4 不同贮藏时间对苜蓿干草Ash 含量的影响

如图4 所示，在贮藏0～120 d，苜蓿干草Ash 含量无异常值。贮藏过程中Ash 含量逐渐增加，贮藏120 d 时Ash 含 量 显 著 高 于0 和30 d 时(P＜ 0.05)。

图4 不同贮藏时间Ash 含量Figure 4 The crude ash (Ash ) content of alfalfa hay at different storage times

贮藏0 d 的Ash 含量为8.54%。贮藏30 d 后，Ash 含量为8.71%，比贮藏0 d 时增加0.17%。贮藏120 d，Ash 含量有明显增加趋势，比0 d 增加0.82%。

2.1.5 不同贮藏时间对苜蓿干草RFV 的影响

贮藏0～120 d，苜蓿干草RFV 含量无异常值。RFV含量在随贮藏时间增加不断显著下降(图5)(P＜ 0.05)。

图5 不同贮藏时间RFV 含量Figure 5 The relative feeding value (RFV) of alfalfa hay at different storage times

贮藏0 d 的RFV 值为135.39，30 d 时为117.43，较0 d 下降了17.96。贮藏60、90 d 分别比0 d 下降了27.54、34.32。RFV 值在贮藏120 d 时最低，有明显的下降趋势，与0 d 相比降低了39.48。

2.2 不同贮藏时间对苜蓿干草氨基酸的影响

2.2.1 不同贮藏时间对苜蓿干草氨基酸含量的影响

总氨基酸含量随苜蓿贮藏期的延长，呈逐渐下降趋势(表1)。不同贮藏时间的总氨基酸含量介于9.499%～12.600%。

表1 不同贮藏时间苜蓿干草氨基酸含量Table 1 The amino acid contents of alfalfa hay at different storage times%

本研究检测出7 种必需氨基酸。不同贮藏时间的必需氨基酸含量介于3.316%～5.031%。苏氨酸含量在0 d 与其他时间段差异显著(P＜ 0.05)，苏氨酸含量介于0.477%～0.579%。不同贮藏时间蛋氨酸含量无显著差异(P＞ 0.05)，介于0.137%～0.249%。赖氨酸含量介于0.516%～0.787%。缬氨酸含量在贮藏120 d 时显著低于贮藏0 d (P＜ 0.05)，介于0.516%～1.038%。异亮氨酸含量介于0.360%～0.682%，0、30 d与其他时间段差异显著(P＜ 0.05)。亮氨酸含量介于0.719%～1.015%，0、30 d 与其他时间段差异显著(P＜ 0.05)。苯丙氨酸含量介于0.590%～0.681%。不同贮藏时间对苯丙氨酸的含量无显著影响(P＞0.05)。

本研究中共检测出10 种非必需氨基酸，不同贮藏时间的非必需氨基酸含量介于6.184%～7.576%。在10 种非必需氨基酸中，有4 种氨基酸含量在不同贮藏期间无显著差异(P＞ 0.05)，分别为天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸和脯氨酸。天冬氨酸含量介于1.494%～1.680%，随贮藏时间的延长逐渐减少。甘氨酸含量介于0.478%～0.542%。脯氨酸含量介于0.934%～1.073%。组氨酸含量介于0.248%～0.280%。丝氨酸含量介于0.548%～0.628%，0 d 与其他时间段的含量差异显著(P＜ 0.05)。谷氨酸含量介于0.992%～1.187%，0 d 与60、90、120 d 差异显著(P＜0.05)。丙氨酸含量介于0.535%～0.635%，0 d 与其他时间段的含量差异显著(P＜ 0.05)。胱氨酸含量介于0.248%～0.511%，90 与120 d 无 显 著 差 异(P＞0.05)。酪氨酸含量介于0.365%～0.502%，0 d 与60、90、120 d 差 异 显 著(P＜ 0.05)。精 氨 酸 含 量 介 于0.342%～0.536%，0 与30 d 无 显 著 差 异(P＞ 0.05)，90 与120 d 无显著差异(P＞ 0.05)。

苜蓿干草的氨基酸含量在不同贮藏期有一定的规律，含量最高的是天冬氨酸，含量最低的是蛋氨酸。苜蓿干草总氨基酸、必需氨基酸和非必需氨基酸含量随贮藏期的延长逐渐减少。贮藏0 和30 d的总氨基酸含量及必需氨基酸含量差异显著(P＜0.05)。贮藏0 和120 d 的非必需氨基酸含量差异显著(P＜ 0.05)。

随着贮藏时间的延长，呈味氨基酸、药用氨基酸、支链氨基酸、芳香族氨基酸，含量呈递减趋势(表2)。药用氨基酸每个贮藏期内占总氨基酸比均最高。

表2 不同贮藏时间苜蓿干草各组成氨基酸比较Table 2 Comparison of the amino acids in alfalfa hay at different storage times

2.2.2 不同贮藏时间苜蓿干草的氨基酸营养价值评价

不同贮藏期的亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸均低于FAO/WHO 模式谱标准(以下简称标准)。异亮氨酸贮藏60 d 后低于标准。蛋氨酸 + 半胱氨酸贮藏90 d后低于标准。缬氨酸贮藏期间均低于标准。苯丙氨酸 + 酪氨酸贮藏期间均高于标准(表3)。苜蓿干草贮藏期间，所含的必需氨基酸含量越接近模式氨基酸的组成，其蛋白质的价值就越高。可以看出，根据计算差值的大小，不同贮藏时间苜蓿干草的第一限制性氨基酸为赖氨酸和亮氨酸。贮藏0 d 时苜蓿干草第二限制性氨基酸为亮氨酸，30 d 时为苏氨酸，60、90 和120 d 时是赖氨酸。其余几种氨基酸含量非常丰富，可以作为优质蛋白饲料进行饲喂。

表3 不同贮藏时间苜蓿干草氨基酸与FAO/WHO 推荐氨基酸模式比较Table 3 Comparison of amino acid patterns in alfalfa hay at different storage times with those recommended by FAO/WHO

如果苜蓿干草在贮藏期间的氨基酸含量与FAO/WHO 模式氨基酸含量相同，则RC 值为1；RC ＞1 表明相对过剩，RC ＜ 1 则表示相对不足。赖氨酸和亮氨酸在贮藏期间RC 均在1 以下(表4)。蛋氨酸 +半胱氨酸在贮藏90 d 后RC 在1 以下。苯丙氨酸 +酪氨酸在贮藏期间RC 均在1 以上。缬氨酸在贮藏60 d 后RC 在1 以下。SRCAA 值则 越接近100，就表明苜蓿干草的氨基酸组成越平衡。本试验中苜蓿干草的SRCAA 值介于73.82～82.08。可以看出，不同贮藏时间苜蓿干草的SRCAA值最高的是30 d。

表4 不同贮藏时间苜蓿干草氨基酸比值系数分Table 4 Ratio coefficients of amino acids in alfalfa hay at different storage times

2.2.3 不同贮藏时间苜蓿干草粗蛋白含量及氨基酸组分含量的相关性分析

对不同贮藏时间苜蓿干草粗蛋白含量及氨基酸组分含量的相关分析(表5)表明，粗蛋白含量与脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸等显著正相关(P＜ 0.05)，而与丙氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸等极显著正相关(P＜ 0.01)。且各氨基酸的组成之间具有更加复杂的相关性。天冬氨酸与谷氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸等极显著正相关(P＜ 0.01)，与苏氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸显著正相关(P＜ 0.05)。苏氨酸与缬氨酸、精氨酸等显著正相关(P＜ 0.05)，与丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)。丝氨酸与酪氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸相关性不显著，与缬氨酸、精氨酸显著正相关(P＜ 0.05)，与其他氨基酸极显著正相关(P＜0.01)。谷氨酸与缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸等显著正相关(P＜ 0.05)，与蛋氨酸、苯丙氨酸相关性不显著，与其他氨基酸极显著正相关(P＜ 0.01)。脯氨酸与丙氨酸、亮氨酸、精氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)，与胱氨酸、异亮氨酸、赖氨酸显著正相关(P＜ 0.05)。甘氨酸与组氨酸、赖氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)，与丙氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸显著正相关(P＜ 0.05)。丙氨酸与胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)，与缬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸显著正相关(P＜0.05)。胱氨酸与异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)。缬氨酸与异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸显著正相关(P＜0.05)。蛋氨酸与精氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)，与其他氨基酸相关性不显著。异亮氨酸与亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)。亮氨酸与酪氨酸、赖氨酸、精氨酸极显著正相关(P＜0.01)。酪氨酸与赖氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)。组氨酸与赖氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)。赖氨酸与精氨酸极显著正相关(P＜ 0.01)。

表5 不同贮藏时间苜蓿干草粗蛋白质蛋白及氨基酸含量的相关性Table 5 Correlation of crude protein and amino acid contents of alfalfa hay at different storage time

2.3 不同贮藏时间对苜蓿干草营养品质的隶属函数综合评价

苜蓿干草的营养品质评价结果(表6)表明，贮藏30 d 的苜蓿干草品质最好，得分为0.69。贮藏时间越长，品质越差，贮藏120 d 的干草品质最差。

表6 不同贮藏时间苜蓿干草营养品质综合评价Table 6 Comprehensive evaluation of alfalfa hay nutritional quality at different storage times

3 讨论

3.1 不同贮藏时间对苜蓿干草常规营养品质变化的影响

营养品质是一个关键的评价指标来衡量饲草品质，直接影响家畜采食的适口性和消化率[18]。CP 含量决定了牧草的营养价值的高或低[19]。Goto 等[20]研究发现苜蓿草捆内粗蛋白含量会随着贮藏期的延长而降低。本研究表明，随着贮藏时间的延长CP 的含量逐渐下降。这一结果与范美超等[21]的研究结果相似。

NDF 作为植物中主要的纤维类物质，通常由半纤维素、纤维素和木质素组成[22]。NDF 有较低和较慢的降解率。过高的NDF 含量可能会使反刍动物在粗饲料中的进食量和利用率受到限制。ADF 含量直接影响牧草消化率，ADF 含量越高消化率越低[22]。王根旺[23]研究表明，适合家畜采食的优质牧草中，ADF 的含量一般占干物质含量40%以下，NDF的含量占干物质的百分含量在50%以下。本研究中随贮藏时间的延长，NDF、ADF 的含量都增加。ADF 含量由最初的35.05%提高到43.56%。NDF含量从最初42.33%提高到53.31%。那亚[24]发现，苜蓿干草NDF 和ADF 含量随贮藏时间的延长逐渐增加，与本研究结果一致。

Ash 是样品燃烧后残留的残渣，可用作衡量牧草中无机矿物质含量的指标[25]。牧草Ash 含量越高品质越差，根据我国豆科牧草干草质量等级标准，干草Ash 含量超过12.0%的为不合格产品[26]。本研究结果显示，随贮藏时间的延长，Ash 含量有所增加，但不到12.0%。

RFV 指反刍动物对饲料的可消化干物质的随意采食量[27]，用来衡量苜蓿干草品质[28]。RFV 值越高，干草品质越好。本研究中，ADF、NDF由于贮藏时间的影响而发生了变化，进而改变了RFV 值。随着贮藏时间的延长，RFV 呈下降趋势。刘鹰昊[29]也发现，干草捆的RFV 含量随着贮藏时间的延长而降低，这与本研究结果一致。

3.2 不同贮藏时间苜蓿干草氨基酸含量及相关性分析

氨基酸是构成蛋白质的基本单位，氨基酸含量、种类和比例等直接影响蛋白质的组成，进而影响牲畜对粗饲料蛋白的吸收和利用，因此氨基酸评价粗饲料饲用价值的重要指标[30]。必需氨基酸指畜禽不能合成或合成速度不能满足自身需求的氨基酸，并且必需从食物中摄取，必须外源获取[31]。非必需氨基酸为畜禽自身可合成的氨基酸。呈味氨基酸的比例和含量会影响牲畜的机体健康[32]。限制性氨基酸是动物体内无法自己合成的氨基酸，并且别的氨基酸无可替代的、动物必不可少的一种氨基酸。因此，这种氨基酸是高品质的饲料所不可缺少的氨基酸，但是不宜过多。 因为限制氨基酸本身不会被动物的生长所吸收，一旦过多对脏器的负担就会加重[33]。除合成蛋白质外，具有其他特殊作用的氨基酸叫做功能性氨基酸[34]。本研究发现，随着贮藏时间的延长，总氨基酸、必需氨基酸和非必需氨基酸的含量逐渐减少。含量最高的是天冬氨酸，含量最低的是蛋氨酸。必需氨基酸的含量与氨基酸的总量成正比。呈味氨基酸的含量是决定饲料适口性的主要因素之一，紫花苜蓿中呈味氨基酸占总氨基酸的36% 以上，提高了牲畜肉类的品质和肉制品的营养价值[35]。本研究发现，苜蓿干草不同贮藏期的第一限制性氨基酸为赖氨酸和亮氨酸。这与Sitompul[36]指出的，赖氨酸和蛋氨酸是饲料中的限制性氨基酸的结果有所不同。本研究发现，氨基酸比值系数分(SRCAA)在贮藏时间为30 d 最高，表明氨基酸营养价值最高，氨基酸组成平衡较好。

粗蛋白含量与脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸等显著正相关(P＜ 0.05)，而与丙氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸等极显著正相关(P＜ 0.01)，且各氨基酸的组成之间具有更加复杂的相关性。这说明不同贮藏期内的粗蛋白含量与每个必需氨基酸组成存在较为密切的相关性。各必需氨基酸成分之间具有复杂的相关性，基本正相关，这说明各成分之间相互促进的关系较好。

3.3 不同贮藏时间对苜蓿干草营养品质的隶属函数综合评价

紫花苜蓿作为经济性粗饲料，如果仅用一种指标或几种指标来评价紫花苜蓿的营养品质或饲用价值，过于片面[37]。隶属函数分析能够综合考虑诸多因素，对营养品质或饲用价值的评价更加客观、全面、合理，结果更加客观、准确[38]。本研究利用隶属函数分析方法综合评价常规营养和氨基酸得出了最佳贮藏时间。

4 结论

苜蓿干草的营养品质随贮藏时间的延长而逐渐下降。本研究共检测出17 种氨基酸，随贮藏时间延长苜蓿干草氨基酸成分的含量逐渐下降。贮藏30 d的氨基酸比值系数分为最高。隶属函数分析法进行综合评价得出贮藏30 d 的苜蓿干草品质最好。综上所述，苜蓿干草随着贮藏时间的延长，其品质呈降低趋势。因此，为保证苜蓿干草品质，减少营养物质损失，贮藏时间应控制在30 d 以内，尽量在30 d之内饲喂家畜，从而取得良好的饲喂效果。