乳酸片球菌J1产胞外多糖发酵条件优化

于文娜，于连升，王烁，赵丹,2，杜仁鹏,2

（1黑龙江大学，生命科学学院，农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江省寒区植物基因与生物发酵重点实验室，黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080；2河北环境工程学院，河北省农业生态安全重点实验室，河北秦皇岛 066102）

0 引言

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)可以产生具有各种功能特性和理化性质的胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)，其通常具有改善乳制品及其他食品的口感、质地，延长食品的保质期，改变发酵产品的外观柔软度等多种功能，因此被作为增稠剂、乳化剂应用在食品行业[1-2]。此外，LAB EPS 还具有抗癌、免疫调节、益生特性、制作防止致病菌粘附的抗生物膜剂、降血糖/降胆固醇等特性，被广泛应用在医药保健、美容化工等领域[3-5]。由于LAB EPS的功能特性和其公认的安全(GRAS)特性，近年来引起广泛的关注[6]。

目前已知可以产EPS的LAB主要有：植物乳杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)、乳 酸 乳 球 菌(Lactococcuslactis)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、干酪乳杆菌(Lactiplantibacilluscasei)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、罗伊氏乳杆菌(Lactiplantibacillusreuteri) 和融合魏斯氏菌(Weissellaconfuse)等[7-9]。关于产EPS的LAB已有很多报道，但是相关研究主要集中在产EPS LAB 的筛选、EPS 合成机制的探索、EPS 构效关系等[10]，而有关EPS的工业化大规模生产的相关研究较少。尽管EPS具有多种优良的理化性质，但LAB EPS 的产量低，限制了EPS 的大规模应用。因此分离筛选高产EPS 的LAB，优化菌株产EPS 的发酵条件，进而提高EPS 的产量可以为工业化生产EPS节省时间和原料成本。大量研究表明，能够影响乳酸菌产EPS的因素有很多，主要包括底物浓度和培养基的理化条件等[11-12]。WANG 等[13]通过单因素试验对柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)B2产EPS的蔗糖、酵母提取物浓度和pH等进行优化，得到了(59.33 ± 1.34)g/L 的EPS，是优化前的5.93 倍。刘丽娜等[14]对W.confuseXG-3产EPS的发酵工艺条件进行优化，EPS产量达到61.03 g/L，相较于优化前提高了44.95%。在之前的研究中，课题组从东北各地域的酸菜中分离并确定了一株产EPS 的P.acidilacticiJ1，菌株产生的EPS具有持水性、抗氧化性、益生特性等众多优良的功能。本研究通过单因素实验，对P.acidilacticiJ1产EPS的发酵条件及培养基成分进行优化，确定了P.acidilacticiJ1产EPS的最佳发酵条件，为EPS的工业应用提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株P.acidilacticiJ1保藏于黑龙江大学生命科学学院微生物重点实验室。

1.1.2 试剂与培养基从天津恒兴化学试剂制造有限公司采购苯酚、浓硫酸、无水乙醇等试验所需试剂，天津致远化学试剂有限公司采购三氯乙酸。检测所需试剂全部为分析纯。

MRS 培养基：葡萄糖20 g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、无水亚硫酸钠0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、柠檬酸铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、无水乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL 108℃高压灭菌20 min，用于供试菌活化及种子液制备。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化将-80℃冰箱保藏的P.acidilacticiJ1以2%的接种量接种于MRS液体培养基中。培养过夜后，在转接两次MRS液体培养基，活化菌株。

1.2.2 EPS 的提取与测定将活化的菌株接种至MRS液体培养基中，30℃，150 r/min，培养5 d。以MRS 培养基为对照组，将菌液稀释不同倍数涂布于MRS平板中，过夜培养后，计算活菌数量。将发酵液12000 r/min离心10 min，取上清液后加入三倍体积的95%乙醇，4℃冰箱中过夜沉淀EPS[15]。分别配制不同浓度葡萄糖标准溶液，随后，将1 mL 葡萄糖溶液和200 μL 6%(w/v)的苯酚溶液放入比色管中，再加入1 mL浓硫酸，经过冷却处理后，测定OD490。以葡萄糖浓度(μg/mL)与OD490作为横纵坐标，绘制标准曲线为y=0.00472x-0.00857，R2=0.9993，通过苯酚-硫酸法测定EPS含量。

1.2.3 培养基成分对P.acidilacticiJ1 生长及产EPS 的影响探索培养基组分及含量对P.acidilacticiJ1 的生长和EPS产量的影响。将葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖和乳糖作为碳源，并考察不同蔗糖浓度对菌株生长及产EPS 的影响。分别添加不同浓度的酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨和柠檬酸铵为菌株生长所需的氮源。同时分别考察K2HPO4、MgSO4、CH3COONa 对菌株产EPS含量的影响。

1.2.4 培养条件对P.acidilacticiJ1 生长及产EPS 的影响以最佳的培养基组成为基础，分别考察不同培养条件对P.acidilacticiJ1 生长和产EPS 的影响。接种量：分别以1、2、3、4、5%的接种量将菌液接种于MRS培养基中，观察不同接种量对菌株生长及产EPS 的影响。酸碱值：考察培养基初始pH 4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5对菌液生长及EPS 产量的影响。温度：考察温度在20、25、30、35、40℃下对菌液生长及EPS 产量的影响。摇床转速：探究100、120、140、160、180 r/min的摇床转速对菌液生长及EPS产量的影响。

1.2.5 数据处理和统计分析通过数据统计软件Origin 2021对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 培养基组分对P.acidilactici J1产EPS的影响

2.1.1 碳源和蔗糖添加量对P.acidilacticiJ1 生长和EPS 产量的影响碳源是细菌维持正常生长及生理代谢过程中的重要营养成分，其种类及添加量是细菌合成EPS过程中的重要影响因素[16]。本研究选用20 g/L麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖5 种碳源对P.acidilacticiJ1生长和EPS产量进行差异分析。结果表明当20 g/L 蔗糖作为P.acidilacticiJ1 的碳源时，菌株的生长情况和EPS产量显著优于其他碳源（表1）。陶静等[17]探究了不同碳源（果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉）对保加利亚乳杆菌(Lactiplantibacillusbulgaricus)EPS产量的影响，表明蔗糖是L.bulgaricus产EPS的最佳碳源。蔗糖可以为L.bulgaricus的生长提供碳源，同时也是L.bulgaricus合成EPS 的诱导剂，当培养基中有蔗糖存在时，葡聚糖蔗糖酶可以催化蔗糖合成EPS。

表1 碳源对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

蔗糖浓度对菌株生长代谢及产EPS的影响如图1所示。蔗糖浓度为20 g/L时EPS产量最少。可能是培养基中的碳源含量过少，未达到菌株正常生理代谢所需的碳源含量。蔗糖浓度70 g/L时菌株产EPS的产量达到最大值(35.72±1.09)g/L。继续提高蔗糖浓度，EPS的产量下降，可能是高浓度的蔗糖会在培养基中产生较大的渗透压，不利于菌株的正常生长和EPS 的产生[15]。

2.1.2 氮源对P.acidilacticiJ1 生长和EPS 产量的影响氮源可以为微生物的正常生理代谢提供必需的氮元素，包括有机氮源和无机氮源[18-19]。由表2 可知，牛肉膏是P.acidilacticiJ1产EPS的最适有机氮源。随后考察了不同添加量的最适有机氮源牛肉膏与无机氮源柠檬酸铵对细菌生长及产EPS的影响，结果如图2(a)，当牛肉膏含量为14 g/L 时EPS 含量达到最大值(43.76±1.07)g/L。如图2(b)，当柠檬酸铵添加量在3.5 g/L 时EPS含量达到最大值(51.39±2.49)g/L。

图2 牛肉膏和柠檬酸铵浓度对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

表2 氮源对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

2.1.3 无机盐对P.acidilacticiJ1 生长和产EPS 的影响无机盐可以为细菌生长和代谢提供必不可少的金属离子及微量元素，不同的无机盐对细菌生长及产EPS 的作用存在差异。磷酸氢二钾、硫酸镁和无水乙酸钠在相同添加量的情况下对P.acidilacticiJ1生长及EPS产量的生长情况如表3。结果显示3 种无机盐对细菌的生长代谢具有不同程度的影响。其中无水乙酸钠对细菌产EPS 的影响最为显著，表明无水乙酸钠是P.acidilacticiJ1合成EPS的关键无机盐。随后探索了不同浓度的无机盐添加量对P.acidilacticiJ1生长及EPS产量的影响，EPS 产量达到最优值分别所需的磷酸氢二钾、硫酸镁、无水乙酸钠浓度为2 g/L、0.3 g/L、4 g/L（图3、图4、图5）。

图3 磷酸氢二钾添加量对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

图4 硫酸镁添加量对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

图5 无水乙酸钠添加量对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

2.2 培养条件对P.acidilactici J1产EPS的影响

2.2.1 接种量对P.acidilacticiJ1 生长和产EPS 的影响接种量会显著影响细菌的生长和繁殖速度，接种量过大会导致细菌溶解氧不足，使菌体缺乏必要的营养，从而阻碍其代谢产物的形成；反之，接种量过小则可能导致菌种的繁殖周期缩短，因此确定菌株最适接种量对工业化生产EPS、降低成本具有重要意义。接种量对细菌生长与产EPS影响如图6所示，接种量在1%时产EPS 的量最少，为(61.42±2.43)g/L。接种量在4%时，EPS 产量达到最大值，为(72.66±2.98)g/L，随后逐渐减小。接种量过低，培养基中菌液数量较少，影响了细菌的培养时间，使细菌达到对数期的时间增长。接种量过高，菌液维持正常生理代谢活动所需的营养含量增加，但在有限的培养基内，营养物质有限，限制了菌液的生长代谢并影响了EPS的合成。

2.2.2 pH 对P.acidilacticiJ1 生长和产EPS 的影响pH是细菌产EPS和维持自身生长代谢过程中重要的理化指标，探索细菌生长代谢过程中的最适pH有利于优化菌株产EPS 的含量。不同pH 对P.acidilacticiJ1 生长和产EPS 的影响如图7 所示，在初始pH 5.5 时，P.acidilacticiJ1的产糖量达到最大值，为(67.74±2.29)g/L，在初始pH 4.5 时产EPS 量最少，为(55.19±1.02)g/L。不同初始pH 对细菌产EPS 含量的影响呈现先升后降的趋势。推测过高或过低的pH 改变了营养物质的溶解度，降低了P.acidilacticiJ1对营养的吸收，进而影响了菌株产EPS 相关酶的活性和稳定性，改变了P.acidilacticiJ1的产EPS效率[20]。当pH 5.5～6.0之间，乳酸菌中葡聚糖蔗糖酶的活性最高，能以蔗糖为底物大量合成EPS。SEESURIYACHAN 等[21]对融合乳杆菌(Lactiplantibacillusconfuses)TISTR 1498 产EPS 的发酵条件进行了优化，结果表明，当碳源为100 g/L 的蔗糖，pH 5.5 时，产生了最高的EPS 产量38.20 g/L，与本研究结果一致。

图7 pH对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

2.2.3 发酵温度对P.acidilacticiJ1 生长和EPS 产量的影响温度可以改变营养物质的运输、产糖相关酶的活性以及物质的溶解度来影响糖的代谢速率[22]。不同的发酵温度对P.acidilacticiJ1产EPS的影响如图8，当温度为20～25℃时，菌株产EPS的量较少。温度较低，可能影响了物质及微量元素的运输，P.acidilacticiJ1的生长较为缓慢，影响了菌株产EPS的效率。当温度达到35℃时EPS的产量达到最大值，为(64.94±2.82)g/L。继续提高发酵温度，菌株的生长以及产EPS 的效率逐渐下降。相关的研究发现，EPS 合成的最适温度普遍低于菌株的最适生长温度[23]。唐华英等[24]优化假肠膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)GX-3的培养温度，结果表明，在30℃时EPS 的合成量达到最大，为(40.27±1.26)g/L。邢瀚文[25]发现Ln.mesenteroidesDRP105 产EPS 的最适生长温度为25℃，EPS 产量高达(39.08±1.31)g/L。本研究结果同上述一致，即最适产EPS温度均低于菌株最适生长温度。

图8 温度对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

2.2.4 摇床转速对P.acidilacticiJ1 生长和EPS 产量的影响摇床转速可以影响培养液中溶解氧的含量，控制产EPS 相关酶的活性，进而控制EPS 的合成[16]。转速对P.acidilacticiJ1 生长及产EPS 的影响如图9 所示，当摇床转速为160 r/min 时，EPS 含量最高，为(67.52±1.02)g/L，当转速为100 r/min 时，EPS 产量最少，为(57.57±2.11)g/L。当培养基转速超过160 r/min后，EPS的产量逐渐下降。

图9 不同的摇床转速对P.acidilactici J1生长和EPS产量的影响

3 讨论与结论

LAB在功能性食品领域发挥着重要的作用，不仅可以增加食品的感官特性，还能提高食品的营养价值[26]。LAB在代谢过程中产生的EPS具有巨大的应用潜力，近年来大量综述性文章总结了LAB EPS的功能及产糖机理[27-29]。然而EPS 的产量受到多种因素的干扰，产量较低，不符合目前多糖类聚合物大规模工业化生产的要求，限制了EPS 的开发和利用，因此提高LAB EPS 的产量是研究的重点。目前关于EPS 发酵优化的方法主要包括：改变底物浓度的添加量、发酵条件的变化、调整细菌接种量等[30-31]。KATJA 等[32]通过优 化 马 乳 酒 样 乳 杆 菌 (Lactiplantibacillus kefiranofaciens)产EPS 的发酵温度、搅拌速率以及碳源、氮源、维生素和矿物质的添加量等，提高了EPS的产量。FERNANDA 等[33]优化Ln.pseudomesenteroides产EPS的发酵温度、pH、碳源添加量等，优化后EPS的产量提高到53.77 mg/mL。由此可见，环境因素诸如碳源、氮源、温度、pH 和无机盐浓度等对LAB 产EPS进程具有重要的影响作用。

P.acidilactici作为一种优良的益生菌，具有产酸、调节肠道生态平衡、抑制病原微生物的生长、增强机体免疫等功能。除此之外，P.acidilactici产生的EPS 对食品化工等行业均具有重要的应用价值。但是目前对于P.acidilactici的研究仅局限于产酸、产乳酸片球菌素等代谢产物的研究上，对于P.acidilactici产EPS 的研究较少。本研究通过单因素试验优化了影响P.acidilactici产EPS的关键因素。在发酵过程中，蔗糖、磷酸氢二钾、无水乙酸钠的添加量对P.acidilactici产EPS 的影响尤为显著，可能是金属离子K+、Na+直接影响菌株葡聚糖蔗糖酶的活性，进而影响EPS的合成，而初始温度、转速对P.acidilactici产EPS 的影响相对较小。此外，研究还发现，不同浓度的培养基成分对菌株产EPS 的影响均呈现出先升高后降低的趋势，这是因为当菌液浓度达到环境所能承受的最大限度时，EPS的含量也会维持在相对稳定或有所降低的水平。胡盼盼[34]研究副干酪乳杆菌(Lactiplantibacillusparacasei)M5L产EPS的条件优化中，接种量、发酵温度、pH等均呈现先升后降低的趋势，与本研究结果相似。pH不仅影响菌体的生长，还对培养基的理化因素具有一定的作用，改变菌体对环境中营养物质的吸收以及代谢反应中葡聚糖蔗糖酶对蔗糖的利用。P.acidilactici属于耐酸性较强的细菌，但是过低的pH 仍不利于菌体生长，当培养基中的初始pH 4.5时，细菌生长受到抑制，但对EPS 的合成影响不大。推测低pH 环境下菌株生长速度缓慢，但是菌液中的糖基转移酶活性较强，不断利用环境中的蔗糖来合成EPS。

本研究通过单因素试验得到了P.acidilactici产EPS 的最佳培养条件为蔗糖70 g/L，牛肉膏14 g/L，柠檬酸铵3.5 g/L，硫酸镁0.3 g/L，无水乙酸钠4 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，接种量4%，培养温度35℃，初始pH 5.5，摇床转速160 r/min，EPS 产量为(72.66±0.02)g/L，相较于优化前(15.27±0.14)g/L 提高了4.76 倍，优化后的产量提升较为明显。其中，蔗糖的添加量对P.acidilactici产EPS的影响最大。本研究结果有助于提高EPS产量，为工业化生产EPS提供理论基础，未来可以通过响应面法来进一步优化P.acidilactici产EPS的发酵条件。