白芨外泌体的分离及对体外人永生化角质形成细胞(Hacat)的凋亡保护研究

2024-04-24施建羽李惠华吴美芳王伟

中国农学通报 2024年6期

施建羽，李惠华，吴美芳，王伟

（福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建厦门 361006）

0 引言

白芨又名“白及”，Bletillastriata(Thunb. ex A.Murray)Rchb.f.，兰科白芨属草本植物，是中国传统中药。其药用部位是干燥块茎，味甘、苦、涩，性偏寒，归胃经、肺经和肝经[1]。白芨的药用价值很高：抑菌、消炎、抗肿瘤、调节免疫、促伤口愈合等[2-3]。其主要成分为天然水溶性多糖，其次为多酚、氨基酸类[4]。目前白芨的应用领域主要涉及：传统中药组方、包合材料、生物黏附材料、水凝胶材料、基因递送载体、血管栓塞材料和聚合物胶束材料等，也可用作祛斑类化妆品[5-7]。随着白芨栽培技术的完善，产量大幅提升，高端加工产品的需求激增。因此，运用现代技术和方法对白芨的成分以及应用场景做进一步的挖掘具有重要意义。

近年来，药用植物外泌体成为新的中药活性成分，引起研究人员的重视。植物外泌体是由植物细胞分泌的、包含了复杂RNA 和蛋白质的细胞外囊泡，其直径在30～200 nm之间，主要参与细胞间的通讯，因具有磷脂双分子层而性质稳定，可保护内含物免受降解并运送至受体细胞[8-10]。2012 年细胞外囊泡国际学会的成立，显示了外泌体在生物学和应用方面的重要性。外泌体除自身具有一定功能之外，还是一种新兴的天然纳米材料，用作药物载体[11-14]。外泌体在原植株细胞乃至跨界细胞或物种间有广泛的应用前景，例如在美容方面：间充质干细胞分泌的外泌体可促烫伤皮肤的恢复及再生[15]，在面部皮肤光损伤修复中，人血小板外泌体被证实安全且疗效显著[16]，毛囊乳头细胞球来源的外泌体可促进毛发生长[17]。

药用植物外泌体是目前医药学、生物学等研究热点之一[11-13]，目前尚未见白芨外泌体分离和功能研究的报导。本研究以鲜白芨块茎为材料，首次进行白芨外泌体的分离，开展其对体外人永生化角质形成细胞(human immortalized keratinocyte，Hacat)的生物活性研究，以期为白芨外泌体在护肤品领域的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜白芨(Bletillastriata)的药用部位块茎，2021 年10 月采收于福建省亚热带植物研究所药用植物资源圃。

1.2 聚乙二醇(PEG)沉淀法提取白芨外泌体

（1）鲜白芨块茎500克榨汁，移至离心管内，2000×g，4℃，30 min 离心。（2）将上清液移至新的离心管中，10000×g，4℃，45 min离心，去除较大的囊泡。（3）取上清，经0.45 μm滤膜过滤，收集过滤液。（4）将上清和相同体积的PEG6000 溶液混匀，4℃过夜。（5）10000×g，4℃，60 min离心，去上清，用3 mL预冷PBS重悬沉淀，透析过夜。（6）将透析完的重悬液转移到EP 管中，10000×g，4℃，60 min 离心，去上清，预冷PBS 重悬沉淀，取20 μL用于透射电镜观察，10 μL用于粒径分析，10 μL用于蛋白提取，剩余外泌体于-80℃保存。

1.3 透射电镜观察白芨外泌体

（1）吸取外泌体10 μL，滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液。（2）醋酸双氧铀10 μL滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟。（3）100 kv进行电镜(Hitachi HT-7700)检测成像。

1.4 白芨外泌体样品粒径分析

（1）吸取外泌体10 μL，稀释到30 μL。（2）先用标准品进行粒径分析仪(NanoFCM N30E)性能测试，合格后方可进行外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释，避免样本堵塞进样针。（3）样本完成检测，即可获得仪器检测外泌体的粒径和浓度信息。

1.5 白芨外泌体样品蛋白提取及浓度测定

（1）37℃速融外泌体，并迅速加入5×的RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay，放射免疫沉淀）裂解液。（2）混匀后在冰上裂解30 min，期间混匀。（3）配制BCA(bicinchoninic acid，聚氰基丙烯酸正丁酯）法测蛋白浓度的标准样品，并取5 μL样品加入到BCA混合液中，混匀。（4）37℃孵育30 min，酶标仪上在OD562 nm处检测吸光值并记录。（5）根据标准曲线算出待测样品蛋白浓度。

1.6 Hacat细胞培养

Hacat 细胞在含有1%双抗、10%胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle medium)高糖培养液中，37℃、5% CO2保持饱和湿度培养，细胞密度约80%～90%时进行常规传代。

1.7 CCK8法检测细胞活力

Hacat细胞按照5000个/孔铺板96孔板，待细胞贴壁后，62.5 μmol/L H2O2处理4 min 进行氧化损伤。之后，弃旧的培养基，向细胞中添加内含10 μg/mL 白芨外泌体的完全培养基。氧化损伤处理的细胞为模型组，正常未处理细胞为对照。48 h后，加入CCK8试剂进行细胞活力检测，2 h内读取OD450值。此时，分别收集对照组、模型组、造模后外泌体处理组的Hacat 细胞，制备Western Blot的样本。

1.8 流式双染检测细胞凋亡

采用生工生物工程股份有限公司生产的E606336-0020 Annexin V（分子量为35k～36 kD 的Ca依赖性磷脂结合蛋白）凋亡检测试剂盒，FITC/PI（Propidium Iodide 碘化丙啶）双染法，按照说明书操作：胰酶消化细胞，1200 r/min，离心5 min 收集细胞，PBS洗涤2次；195 μL 1×Binding buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC，4℃避光孵育10～15 min；加入200 μL 1×Binding buffer 洗涤细胞、1200 r/min 离心5 min，移除上清；190 μL 1×Binding buffer 悬浮细胞；加10 μL PI混匀后上机检测。

1.9 Western Blot检测蛋白表达水平

提取细胞的总蛋白，经BCA法定量和蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V恒压电泳后将蛋白转移至聚二偏氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白室温封闭1 h；用5% BSA稀释一抗Anti-BCL-2(1:1000)、Anti- Caspse- 3(1:1000)、Anti- Caspase- 9(1:1000)，放入PVDF 膜，4℃过夜，TBST（洗涤缓冲液一种：T:Tris；B:Buffer；S:Solution；T:Tween）洗膜3 次；放入山羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗膜5次；然后用电化学发光(ECL)显影。抗体及生化试剂购自生工生物工程股份有限公司。以β-actin 作为内参，采用Photoshop 5.0软件对各条带的总灰度值作相对定量分析。具体方法参考文献[18]。

1.10 数据

每个试验3 次生物学重复，1.7 中细胞活力设6 次生物学重复，数据采用SPSS软件进行生统分析。其余试验数据用Duncan法进行多重比较，表示为3次重复的平均值±SE，标有不同小写字母表示组间差异显著(P＜0.05)，标有相同小写字母表示组间差异不显著(P＞0.05)；标有不同大写字母表示组间差异显著(P＜0.01)，标有相同大写字母表示组间差异不显著(P＞0.01)。

2 结果与分析

2.1 外泌体形态及大小

采用PEG沉淀法，由鲜白芨块茎分离的外泌体标注为：白芨外泌体(B-exo)。图1所示：在透射电镜下可以看到白芨外泌体具有十分明显的膜结构，呈现茶杯状；粒径分析仪检测，白芨外泌体粒径为69.63 nm，500 g鲜样提取白芨外泌体35 mL，每毫升白芨外泌体的颗粒数为7.48E+9 Particles，每克鲜白芨外泌体的颗粒数为5.24E+8 Particles。基于形态完整性判断，采用PEG沉淀法提取的白芨外泌体可用于后续研究。

图1 白芨外泌体透射电子显微镜图和平均粒径示意图

2.2 白芨外泌体蛋白指标检测结果

采用BCA 法检测蛋白浓度，结果表明：外泌体蛋白测出的OD562 nm 为0.0945 代入到标准曲线绘制的公式(1)进行计算，得到白芨外泌体蛋白浓度为0.223 μg/μL（加裂解液），换算得到未添加裂解液的白芨外泌体原蛋白浓度为0.279 μg/μL，并根据此数据进行后续实验定量。结合以上蛋白浓度和样本的起始量可知，每克白芨鲜样中含外泌体蛋白19.53 μg。

式中x表示OD562，y表示标准浓度(μg/mL)。

2.3 CCK8法检测细胞存活率

CCK8检测不同浓度白芨外泌体对人永生化角质形成细胞(Hacat)存活率影响，结果如表1所示。

表1 不同浓度白芨外泌体对Hacat细胞存活率的影响

与空白对照相比，5 μg/mL 以上的白芨外泌体处理均可以显著提高Hacat细胞的存活率(P<0.05)，并且随着白芨外泌体处理浓度的提高，Hacat细胞存活率也逐渐提高，10 μg/mL与20 μg/mL的处理没有显著性差异。说明一定浓度的白芨外泌体在一定程度上可以显著提高Hacat细胞的存活率，也有饱和浓度。

2.4 细胞凋亡检测

流式细胞仪检测结果，如图2 所示。H2O2氧化损伤处理后，Hacat 细胞凋亡水平显著上调(P<0.01)。Hacat细胞经氧化损伤再添加10 μg/mL白芨外泌体处理48 h，与氧化损伤模型组比较，Hacat 细胞凋亡程度均显著降低(P<0.01)。

图2 细胞凋亡检测

表2数据分析表明：氧化损伤模型组造模有效，白芨外泌体处理组能够显著降低氧化损伤引起的Hacat细胞早凋亡、晚凋亡和总凋亡的细胞比例(P<0.01)。

表2 白芨外泌体对Hacat细胞凋亡的影响

2.5 蛋白印迹法检测Hacat细胞凋亡相关通路蛋白

Hacat 细胞经H2O2氧化损伤处理造模，模型组用白芨外泌体10 μg/mL 干预48 h。蛋白印迹法检测发现：与对照组相比，模型组细胞的caspase-9和caspase-3 表达显著上升，而Bcl-2 表达量无显著差异；与模型组相比，白芨外泌体处理组的caspase-9和caspase-3表达显著下降，且低于对照组，而Bcl-2表达量无显著差异(P<0.05)（图3）。采用半定量扫描分析，以β-Actin为蛋白上样量的内参，对照组、模型组和外泌体处理组计算灰度比的相对值结果如下：caspase-9 分别为1.000，1.325±0.012，0.847±0.006；caspase-3 分别为1.000，1.313±0.025，0.856±0.011；Bcl-2 分别为1.000，1.090±0.024，1.047±0.016。

图3 Hacat细胞经氧化造模和外泌体处理后相关凋亡蛋白的表达

3 讨论

3.1 PEG沉淀法适合白芨外泌体的分离

已有研究表明，外泌体的提取方法有超速离心法、超滤离心法、多聚物沉淀法、密度梯度离心法、免疫磁珠法以及尺寸排阻色谱法等[19-20]。方法各有优缺点。目前最广泛采用的超速离心法，虽然操作简单且易保持外泌体的完整性，但对仪器设备的要求较高，需要超高速离心机的转速>100000 r/min，4℃，满足此条件的离心机价格昂贵[20]。本研究中白芨外泌体的分离采用的是PEG沉淀法，属于多聚物沉淀法。PEG早已广泛用于浓缩和纯化病毒，因为外泌体与病毒有着较为相似的生物物理特性，研究人员尝试用PEG法分离外泌体，较其他方法提取成本更廉价[21]。本研究中，采用PEG6000 在4℃条件下，过夜沉淀白芨外泌体，整个分离过程中最大的离心力为10000×g，此提取条件绝大多数实验室均可以满足，且成本低廉，与已有报导相符。不过也有研究表明，PEG可能会干扰目标分离物从而影响后续试验[19]。本研究中，透射电镜下白芨外泌体保留完整的膜结构；Hacat 细胞存活率、细胞凋亡检测及蛋白印迹法检测凋亡相关通路蛋白的实验结果均显示PEG 沉淀法保留了白芨外泌体的生物活性。因此PEG沉淀法适合于白芨外泌体的分离，可为其他植物外泌体的提取提供参考。

3.2 白芨外泌体对氧化损伤引起的Hacat 细胞凋亡与Caspase 依赖性凋亡途径相关

从已知的哺乳动物细胞的内源性和外源性凋亡途径[22]可知：Bcl-2 位于调控网络的上游，不局限于调控下游Caspase 蛋白；Caspase-9 位于调控网络的枢纽位置，能被多个因子调控；Caspase-3位于Caspase-9的下游。已有研究表明：Caspase蛋白是一类与凋亡相关的蛋白酶家族，Caspase-9 为凋亡始动子，属启动型蛋白酶，位于级联反应的上游[23]。Caspase-3 为凋亡效应子，属执行型蛋白酶，位于级联反应的下游，能被上游的始动子激活，一旦被激活会触发下游级联反应，使凋亡不可避免[24]。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白的代表[25]。本研究表明：H2O2氧化损伤模型中Caspase-3、Caspase-9含量增加，说明在模型组的Hacat细胞凋亡过程中，Caspase依赖性凋亡途径激活[26]。与模型组相比，白芨外泌体干预组的Caspase-9 和Caspase-3 表达显著下降，且低于对照组，说明在外泌体干预下，经H2O2氧化损伤的Hacat细胞凋亡过程中，Caspase 依赖性凋亡途径被抑制。Caspase-9 和Caspase-3表达呈现出正相关性，与已有研究相符。在本项目的实验中，对照组、氧化造模组、外泌体处理组当中Bcl-2 表达均无显著性变化，说明实验涉及的Hacat细胞凋亡过程与Bcl-2无关，与已有研究Bcl-2位于调控网络的上游，不局限于调控下游Caspase 蛋白相符。本研究通过流式双染检测证实白芨外泌体对Hacat细胞凋亡的抑制作用，并通过蛋白印迹法对其可能的相关通路蛋白做了初探，两部分内容相互佐证，证实白芨外泌体对氧化损伤引起的Hacat细胞凋亡具有抑制作用，但鉴于凋亡途径的复杂性[22]，其Caspase 途径上游的影响因子、相关基因及更深入的凋亡分子机理研究还需进一步试验。

3.3 在益肤方面白芨外泌体是传统白芨制剂的有益补充

已有研究发现：将白芨加水搅拌后形成的凝胶，涂抹于大鼠背部全层皮肤缺损创面，能显著促进创面肉芽组织、毛细血管生长及创面组织血管内皮生长因子的高表达，具有抗炎、镇痛作用，具有显著的止血功效[26]。白芨凝胶中最主要的成分是白芨多糖，其作为一种优良的天然增稠剂，可应用于各种化妆品，代替化学增稠剂，减少对皮肤的刺激，同时也可作为悬浮剂、保湿剂和助乳化剂应用于化妆品中，且均具有良好的效果[4]。人皮肤角质层的紧密结构是限制物质进出皮肤的主要屏障，小分子物质、兼具脂溶性和水溶性的物质更易于渗透[27-28]。

白芨多糖为大分子，并具有黏性，虽然在开放性伤口上有很好的促修复功效，但涂抹在正常皮肤上，其大分子的特性在一定程度上会限制其透皮吸收率。本研究中白芨外泌体粒径为69.63 nm，天然纳米级，易于穿过角质层；且有磷脂双分子层结构，可能包裹miRNA等核酸成分使其免受降解，从而可以在基因层面对皮肤进行调控，这是外泌体成为研究热点的重要原因，也是今后研究的方向。因此将白芨外泌体易吸收、促细胞增殖、抑制凋亡的活性，与传统白芨多糖凝胶保湿增稠及促修复的活性相结合，例如：形成白芨外泌体A液（小分子，易吸收，先涂抹），白芨多糖B液（大分子，保湿，后涂抹）。类似组合可能在护肤领域有一定的开发潜能。