基于代谢组学探究疏调气机汤治疗甲状腺功能减退症的作用机制

郭爽,张利军,龙小妹,古建兴,刘海鹏,范源,3

(1.云南中医药大学中药学院,云南 昆明 650500;2.云南中医药大学第二附属医院,云南 昆明 650041;3.云南中医药大学第一附属医院,云南 昆明 650021)

甲状腺功能减退症(hypothyroidism),简称甲减,是由于甲状腺激素合成及分泌减少,或其生理效应不足所致机体代谢降低的一种疾病。流行病学显示,我国甲减患病率约为17.8%,且女性患病率大于男性,随年龄增长,患病率增加[1]。临床多以药物优甲乐为主,但需长期用药。我国是世界上认识甲状腺疾病最早的国家[2],中医理论中并无甲状腺疾病的概念,将颈前喉结两旁结块肿大为临床特征的疾病归类为“瘿病”范畴[3]。情志内伤、水土因素、体质因素和外感六邪导致气滞、血瘀、痰凝结于颈部,是瘿病的基本病机,临床多以疏肝健脾、理气和血为主。

疏调气机汤是国医大师张震的用药经方,他认为疏调人体气机须以疏利理气与调护脾肾相结合,提出“疏肝为体,健脾补肾为两翼”之基本治疗理念[4]。疏调气机汤以柴胡、香附、郁金、丹参、川芎、枳实、白芍、白术、茯苓、山药、仙灵脾、薄荷和生甘草组成,具有疏调气机之功效,临床甲减可用以治疗气机失调诸证[5]。甲减在中医辨证中主要表现为肾阳亏虚、脾肾阳虚、心肾阳虚、气血两虚、阴阳两虚等症状[6];疏调气机汤治疗甲减,可养其脾肾,补其气虚,起到对症治疗的效果。本研究通过代谢组学探究疏调气机汤治疗甲减作用机制,可为后续单体治疗甲减及甲减的临床治疗提供实验数据及新思路。

1 材料

1.1 仪器质谱仪(Thermo Scientufic公司);Nexera X2 LC-30AD超高效液相色谱仪(Shimadzu公司);Bioruptor超声波系统(Diagenode公司);Concentrator真空离心浓缩机(Eppendorf公司);5430R离心机(Eppendorf公司);MultiSkan FC可见紫外分光光度计(Thermo公司)。

1.2 试剂甲醇、乙腈、甲酸(Millipore公司);氨水(Merck公司);乙酸铵(Sigma公司);水合氯醛(天津市光复精细化工研究所);促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH)、血清游离三碘甲状腺原氨酸(Free Triiodothyronine,FT3)、血清游离甲状腺素(Free Thyroxine,FT4)试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 药物中药饮片柴胡、香附、郁金、丹参、川芎、枳实、白芍、白术、茯苓、山药、仙灵脾、薄荷、生甘草均购自昆明益生药业有限责任公司,饮片均由云南中医药大学中药资源教研室李宏哲副教授鉴定为临床药用饮片;优甲乐(Merck KGaA公司,批号:JX20190041);丙硫氧嘧啶(上海朝晖药业有限公司,批号:2108N13)。

1.4 动物30只SPF级雄性SD大鼠,体重均为(200±10)g,购于云南致力科技有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010,饲养于云南中医药大学动物房,大鼠生长环境为室温25 ℃,湿度60%,自由饮水。动物实验研究方案已经云南中医药大学动物伦理委员会批准(批准号:R-062021G088)。

2 方法

2.1 动物模型建立及给药SD大鼠适应性喂养1周,随机分为正常组5只和造模组25只。造模组大鼠进行丙硫氧嘧啶(1 mg/100 g)每天灌胃给药造模两周。两周后眼底静脉取血,离心得上清,检测TSH、FT3、FT4指标变化水平,确定模型建立成功。将造模成功大鼠随机分为模型对照组、阳性药(优甲乐)组(9 μg·kg-1)、疏调气机汤低浓度组(10.3 g·kg-1)、疏调气机汤中浓度组(20.6 g·kg-1)、疏调气机汤高浓度组(41.2 g·kg-1),每组5只。给药组分别进行灌胃,正常组和模型对照组同等剂量饮用水灌胃,持续给药6周。大鼠末次给药后,夜间禁食12 h,自由饮水,称重,腹腔注射水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,静置4 h,4 ℃,5 000 r·min-1离心取血清并分装,-80 ℃保存。取甲状腺组织置离心管内,液氮速冻后-80 ℃保存。

2.2 生化指标检测大鼠腹主动脉取血,离心,取上清,试剂盒ELISA检测FT3、FT4、TSH浓度,比较表达水平。

2.3 血清代谢组学对血清进行代谢物提取,取上清液进行LC-MS/MS检测。色谱分析采用SHIMADZU-LC30超高效液相色谱系统使用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(1.7 μm,2.1 mm × 100 mm)进行分离。色谱分离条件:进样量为3 μL,柱温25 ℃,流速0.3 mL·min-1;流动相A:水+25 mmol·L-1乙酸铵,B:乙腈。质谱分别采用电喷雾电离(ESI)进行正离子和负离子模式检测,样品经UHPLC分离后,使用QE Plus质谱仪进行质谱分析,使用HESI源进行离子化。使用MSDIAL软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。对得到的数据,删除组内缺失值>50%的离子峰,对正负离子数据进行总峰面积归一化,并整合,使用R软件进行模式识别,数据经Unit variance scaling(UV)预处理后,进行后续数据分析。

2.4 统计学分析所有实验数据均采用统计学方法处理,采用SPSS 19.0统计软件,多组间数据差异显著性方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠模型建立体重及进食量变化每天记录大鼠体重,同时称重两次灌胃之间24 h饲料重量,计算差值,观察大鼠进食情况。造模期间,正常组与模型对照组大鼠体重均增加,但模型对照组体重增长呈均匀线性增长,正常组每天无明显增长趋势。模型对照组大鼠进食量明显小于正常组,且随着造模时间增加,进食量差异越明显(见表1)。

表1 大鼠体重、进食表

3.2 大鼠血清指数水平变化大鼠给药6周后血清ELISA检测指标表达水平,与正常组相比,疏调气机汤对甲减大鼠TSH存在明显的降低作用,可显著增加FT3、FT4表达水平(见图1)。

a.TSH;b.FT3;c.FT4;C.正常组;M模型对照组;Y.阳性药组;D.疏调气机汤低浓度组;Z.疏调气机汤中浓度组;G.疏调气机汤高浓度组

3.3 大鼠血清代谢组学分析

3.3.1 血清正、负离子色谱对比大鼠血清正、负离子色谱峰3个样本重复结果,表明代谢物检测总离子流的曲线重叠性高,信号稳定性较好(见图2)。

A.正离子;B.负离子

3.3.2 主成分分析偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)是一种有监督的判别分析统计方法。该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样品类别之间的关系模型,来实现对样品类别的预测。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)是一种有监督的判别分析统计方法,R2Y和Q2越接近于1,模型越稳定可靠。从图3中可见,R2Y均大于0.99,Q2均大于0.5,即表明模型稳定,且模型的预测能力好(R2、Q2为回归直线与Y轴的截距)。

A.PCA;B.OPLS-DA

3.3.3 差异代谢物筛选以 VIP>1,P<0.05,差异倍数(FC)>1.5 为上调, FC<0.667为下调作为筛选标准选取显著差异代谢物。正常组与模型对照组比较,共有312个显著差异代谢物,其中111个代谢物水平上调,198个代谢物水平下调,根据VIP值排序,比较模型对照组与正常组血清潜在标记物,对前20个代谢物进行信息汇总(见表2)。疏调气机汤高剂量组与模型对照组比较,共有91个显著差异代谢物,其中有47个代谢物水平上调,39个代谢物水平下调,选择前50个血清潜在标记物作热图以明显表示其变化(见图4),颜色越红表示相对表达量越高,越蓝表示相对表达量越低。

图4 大鼠血清差异代谢物聚类热图

表2 前20血清标记物信息(C vs M)

3.3.4 代谢通路分析根据“3.3.3”项下分析所得,对血清潜在标记物进行分类(见图5),对KEGG分析所得前30条作用通路作气泡图(见图6),结果显示血清潜在标记物主要为生物碱类(alkaloids)、缩氨酸类(peptides)、聚酮类(polyketides)、脂肪酰基类(FA)、异戊二烯脂类(prenol lipids)等;主要作用通路为中心碳循环、氨基酸生物合成、胆汁分泌等信号通路。

图5 差异代谢物KEGG分类环形图

图6 KEGG富集通路气泡图

4 讨论

相关研究表明,部分中药方剂对甲减具有良好的治疗作用:海藻玉壶汤可明显改善甲状腺肿大,保护肝肾功能[7-8];右归丸可明显改善甲减阳虚证大鼠症状,起到温肾壮阳、滋补精血的作用[9];芪桂汤通过调节下丘脑-垂体-甲状腺轴,发挥其补肾助阳、益气健脾功效,对甲减大鼠起到治疗作用[10]。经实验结果显示,疏调气机汤能明显降低大鼠血清TSH表达水平,升高FT3、FT4表达水平,改善甲减表征,存在较好的治疗效果。相关文献表明,FT3、FT4、TSH可视为甲减的最佳生物标记物[11],即表明本实验所用血清标记物可作为治疗效果评估的指标[12]。

疏调气机汤具有疏肝理气、健脾补肾,辅以活血清热、化痰消积功效,方中柴胡疏肝解郁、调达气血;香附、郁金疏肝行气,增强柴胡之功;丹参活血祛瘀;川芎活血行气;茯苓与白术健脾益气、燥湿利水;薄荷疏肝行气,枳实破气宽中,增强疏调气机之功;仙灵脾温补肾阳,与茯苓、白术调护先后天之本;生甘草调和诸药,缓和药性;白芍养血敛阴、平肝柔肝,与甘草配伍,则“酸甘化阴”更能发挥其柔肝养血缓急之作用。诸药共奏疏肝解郁、调补脾肾、理气和血之功效,适用于肝气郁结、气机失畅、脾肾不足之疾病[13]。

在本研究中,疏调气机汤对甲减大鼠血清内代谢组分析,主要代谢物TOP 5分别是花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、麦角克碱、半乳糖醛酸、α-酮戊二酸。花生四烯酸是人体大脑和视神经发育的重要物质,在体内可诱导血小板聚集和刺激脂多糖[14],具有抗炎[15]、影响脂代谢等作用[16];DHA在大脑及神经发育中起到作用,具有抗炎、促凋亡等药理作用[17-18];麦角克碱临床常用于治疗闭经、月经不调、雄性激素低下等疾病治疗[19];半乳糖醛酸具有抗氧化等活性[20];α-酮戊二酸为三羧酸循环的中间产物,具有抗癌[21]、抗氧化[22]等药理作用,以上变化说明疏调气机汤在治疗甲减的治疗机制中,可影响三羧酸循环、神经递质代谢、脂代谢等,提示疏调气机汤对甲减的治疗作用多以调节抗炎、抗氧化代谢为主。

综上,疏调气机汤对甲减具有良好的治疗作用,通过对大鼠血清潜在标记物分析,疏调气机汤可调节部分血清标记物变化,可在一定程度上影响大鼠代谢,起到抗炎等药物活性,进而发挥治疗作用;利用血清标记物对机制进行预测,涉及多条作用机制,其具体机制还需深入探究。本实验为甲减临床治疗及疏调气机汤应用提供实验数据,可为后续相关实验提供新思路。