萝卜黑腐病的病原鉴定及室内药剂筛选

杨利娟，高苇，李海燕，薛涛，张春祥，王勇

（1天津市农业科学院植物保护研究所，天津 300384；2天津市农业发展服务中心，天津 300061；3扬州大学农学院，江苏扬州 225009）

0 引言

萝卜是十字花科萝卜属一年生或二年生作物，是国内重要的蔬菜作物之一[1]，在民间有“小人参”的美称[2]。天津市种植萝卜已有600 多年的历史[3]，卫青萝卜是天津萝卜的代表，最受人们的青睐，作为天津口岸独有的传统出口商品一直远销日本、东南亚和港澳等地区，并在2019年入选中国农业品牌目录。随着经济发展和种植面积的扩大，现已形成西青区沙窝萝卜、津南区葛沽萝卜和武清区田水铺萝卜3个新的萝卜主产地类型的卫青萝卜，均以设施栽培为主[4]。2021 年秋冬季在天津市西青区辛口镇调研萝卜病害发现，由于连茬种植和设施栽培小气候条件的影响，一种不同于常见软腐病症状[5-6]的细菌性腐烂病大面积发生，并逐年加重，严重地块发病率50%以上，因农户病害诊断不明，选药不准确，未能有效控制该病害的快速蔓延，严重影响萝卜的品质和产量，甚至部分地块出现绝收。查阅文献发现，该病害发病症状与已报道的萝卜黑腐病症状相似[7-9]，即病原菌主要危害叶和根，幼叶片发病一般从老叶开始向上蔓延，先从叶缘处产生黄色病斑，逐渐变成“V”字形向内扩展，随后全叶呈花斑网纹状，叶脉变黑，逐渐枯黄，最后干枯腐烂；病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，肉质根受侵染后，先是维管束呈放射状，黑褐色，重者菌脓溢出，甚至干缩空洞。目前，尚无登记在萝卜细菌性病害防治的药剂，生产上常参考其他作物细菌性病害防治技术防治萝卜细菌性病害，造成不科学用药问题较为突出，抗性风险高，缺乏有效防治萝卜细菌性病害技术。基于天津地区萝卜该类细菌性病害病原及有效防治药剂研究缺乏的现状，本研究对该病害的病原进行组织分离、形态观察、致病性测定及分子生物学鉴定，同时进行20种常见杀菌剂的抑菌试验，以期筛选较好的杀菌剂，为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样来源

2021 年从天津市西青区辛口镇采集大量萝卜黑腐病发病植株。

1.2 供试药剂

20个试验药剂分别是98%硫酸链霉素原药（北京索宝来科技有限公司）、20%松脂酸铜水乳剂（江西禾益化工股份有限公司）、27.12%碱式硫酸铜悬浮剂（澳大利亚纽发姆有限公司）、86.2%氧化亚铜可湿性粉剂（天津市绿亨化工有限公司）、20%乙酸铜可湿性粉剂（山东省青岛瀚生生物科技股份有限公司）、20%噻森铜悬浮剂（浙江东风化工有限公司）、15%络氨铜水剂（天津博克百胜科技有限公司）、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂（黑龙江省齐齐哈尔四友化工有限公司）、10%混合氨基酸铜水剂（霍州市绿洲农药有限公司）、30%王铜悬浮剂（山东省青岛瀚生生物科技股份有限公司）、46%氢氧化铜水分散粒剂（科迪华农业科技有限责任公司）、77%硫酸铜钙可湿性粉剂（陕西汤普森生物科技有限公司）、20%噻菌铜悬浮剂（浙江龙湾化工有限公司）、80%代森锌水分散粒剂（山东鑫星农药有限公司）、70%代森联水分散粒剂（巴斯夫欧洲公司）、5%大蒜素微乳剂（成都新朝阳作物科学股份有限公司）、80%乙蒜素乳油（山东省德州祥龙生化有限公司）、6%低聚糖素水剂（海南正业中农高科股份有限公司）、20%春雷霉素水分散粒剂（陕西华戎凯威生物有限公司）、0.3%四霉素水剂（辽宁微科生物工程股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样本采集2021 年12 月在天津市西青区辛口镇采集萝卜黑腐病发病植株，观察并记录发病症状，采集典型症状的发病植株放入采样袋，带回实验室待病原菌的分离。

1.3.2 病原菌的分离纯化取病健交界处组织，进行表面消毒后，采用平板画线分离法在NA 培养基上分离纯化，分离纯化的菌株接入NA 试管中，于4℃冰箱中保存备用。

1.3.3 病原菌的致病力鉴定将分离纯化的5株菌株单菌落分别接种到液体NB培养基中，置于摇床中28℃、150 r/min培养至对数期，细菌浓度约108cfu/mL时，用移液器将菌液滴加健康萝卜的横切面上，3次重复，以无菌水为对照，置于28℃、75%RH培养箱中培养，观察发病情况，对发病萝卜进行病原菌的再分离。

1.3.4 分子生物学鉴定将分离获得的5个菌株分别培养至对数期，采用TSINGKE TSE011 T5 Direct PCR Kit(Plant)提取基因组DNA，采用通用引物27F/1492R[10](5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’/ 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)进行扩增，将扩增获得的产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，并将所得序列与NCBI数据库进行BLAST序列比对，使用MEGA 5.2构建系统发育进化树。

1.3.5 室内生物活性测定采用K-B 滤纸片扩散法[11]，用NB 培养基培养菌株LOC 并配制浓度为108cfu/mL的细菌悬浮液，吸取100 μL菌悬液滴加到直径9 cm的无菌NA平板表面，用无菌玻璃涂布器均匀涂布，涂菌后室温干燥3 min。用无菌水分别将供试药剂配制成100、200、500、1000、2000、3000 mg/L（有效成分量）的药液，用无菌镊子夹直径为6 mm 的灭菌滤纸片浸泡于配制好的药液中，浸泡片刻后立即将纸片平放于直径为9 cm含菌NA平板表面，每皿贴3张纸片，以浸泡灭菌水的灭菌滤纸片为对照，重复3次，置于28℃培养箱中培养，培养36 h后观察测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 田间症状

叶片上出现由边缘扩展的黄色病斑，后期叶片整个黄化、干枯，叶柄上表现出黑褐色萎蔫干枯（图1A～B）；萝卜表面完好，切开后出现黑褐色水浸状腐烂（图1C），或是内部中空、黑心、干枯（图1D）；萝卜内部出现黑色点状病变（图1E）。

图1 萝卜黑腐病田间发病症状

2.2 病原形态特征

从病部分离纯化的菌株在NA培养基上画线培养48 h后出现形态一致的单菌落，初为淡黄色，后变为蜡黄色，有光泽，边缘完整略有凸起（图2A），革兰氏阴性。

2.3 病原致病力鉴定

从病组织中分离纯化到5 株细菌菌株，分别是LOA、LOB、LOC、LOD和LOE。将上述菌株分别接种到健康的萝卜横切面上，5株细菌菌株在接种后3～5 d均出现典型症状（图2B），且病斑症状与田间症状一致，从接种后发病部位分离的菌株与供试细菌菌株的菌落特征相同，而接种无菌水的对照未见任何症状。

2.4 16S rDNA扩增及序列分析

将测序结果与NCBI 数据库中序列进行BLAST比对分析，发现5 株菌株（LOA、LOB、LOC、LOD 和LOE）均与野油菜黄单胞杆菌野油菜黑腐病致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris)相似度达到99%。系统发育树显示，5 株菌株与Xanthomonas campestrispv.campestris聚在一个分支上，支持率为99%（图3）。结合形态学特征和分子生物学鉴定结果，明确病原为野油菜黄单胞杆菌野油菜黑腐病致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris)。

图3 系统发育树

2.5 病原对供试药剂的敏感性测定

如表1 所示，在试验浓度100～3000 mg/L（有效成分浓度，下同）范围内，供试的20种杀菌剂对萝卜黑腐病病原的抑制作用不同。0.3%四霉素水剂对病原的抑制效果最好，在浓度为100 mg/L时对病原有明显的抑菌圈，随着浓度增加，抑菌圈增大，即抑菌效果增强；其次是80%乙蒜素乳油和98%硫酸链霉素原药，在浓度500 mg/L时对病原有明显的抑菌圈，在相同浓度下前者抑菌效果好于后者，随着这2种杀菌剂浓度增加，抑菌圈增大；相较于前3种杀菌剂，20%松脂酸铜水乳剂、86.2%氧化亚铜可湿性粉剂、20%乙酸铜可湿性粉剂、20%噻森铜悬浮剂、15%络氨铜水剂、70%代森联水分散粒剂、6%低聚糖素水剂、30%琥珀肥酸铜可湿性粉剂、10%混合氨基酸铜水剂和30%王铜悬浮剂在更高浓度下可见抑菌圈，但都很小；而27.12%碱式硫酸铜悬浮剂、46%氢氧化铜水分散粒剂、77%硫酸铜钙可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、80%代森锌水分散粒剂、5%大蒜素微乳剂和20%春雷霉素水分散粒剂在最高浓度3000 mg/L 时对病原仍无抑菌圈产生，无抑菌效果。

表1 20种杀菌剂对菌株LOC的抑菌效果mm

3 结论与讨论

本研究分离自天津市西青区辛口镇的萝卜细菌性病害的病原，经过形态观察、致病性测定和16S rDNA序列分析，明确病原为野油菜黄单胞杆菌野油菜黑腐病致病变种(Xanthomonascampestrispv.campestris)，属于细菌界薄壁菌门，与萝卜黑腐病为同一种病原。据报道，该病原在国内主要危害萝卜、甘蓝、白菜、芥菜、荠菜等10 余种十字花科蔬菜，该病原在种子、病残体及土壤中越冬，通过带菌菜苗、农具或者暴风雨传播，在重茬、排水不良、地势低洼、早播等地块病害加重[12-13]。因此，在萝卜栽培管理前需要明确上茬种植情况，结合该病原传播和侵染特性，在病害发生较重的地块，合理安排与非十字花科作物进行轮作倒茬，减轻萝卜黑腐病的发生与为害。

萝卜黑腐病的防治方法主要包括农业防治、物理防治和化学防治。农业防治主要是选择抗病品种，栽培管理上清除病残体，与非十字花科蔬菜轮作。抗黑腐病萝卜种子资源相对较少，刘钊[14]从30份萝卜种质中筛选出2 份高抗黑腐病材料‘贵妃脆B3×S3’和‘贵妃脆B12×A52’，抗病材料11 份；李建萍等[15]指出‘亚美白春’和‘日本耐病长龙’2 个品种可以推广到实际生产中应用；Wu等[16]利用高密度遗传图谱定位到了2个与黑腐病抗性相关的QTL，奠定了抗黑腐病分子辅助育种的基础。此外，田景芝等[17]在萝卜地施用土壤调理剂有效改良了土壤理化性质，提高了萝卜抗黑腐病的能力，实现了提质和增产。物理防治主要是萝卜播种前采用50℃温汤浸种25 min 处理种子。化学防治主要有3个方面，一是采用化学药剂种子处理，即采用种子重量0.2%的50%福美双可湿性粉剂或35%甲霜灵拌种剂拌种[18]；二是土壤处理，播种前施50%福美双可湿性粉剂[18-19]；三是采用化学药剂喷施或灌根处理，是生产中使用最多的防治方法，已报道用在萝卜黑腐病防治的药剂有72%农用链霉素可湿性粉剂500倍液、47%春雷·王铜可湿性粉剂700倍液、新植霉素100万单位5000 倍液、50%瑞毒铜可湿性粉剂700 倍液、77%可杀得可湿性粉剂500 倍液和14%络氨铜水剂300 倍液等[12,19-22]。在实际生产中，农用硫酸链霉素对包括萝卜黑腐病在内的多种细菌性病害均有较高的防治效果而被广泛应用[19-25]，因其对人类健康有风险，农用硫酸链霉素在国内已禁止生产使用，在2018年6月15日正式退出农业市场[26]，造成在细菌性病害防治中依赖使用农用链霉素的农户出现选药经验缺乏等问题。

本研究评价了20 种常见杀菌剂对萝卜黑腐病病原的抑菌效果，并以98%硫酸链霉素原药为对照药剂，比较供试杀菌剂的抑菌活性，为生产上萝卜黑腐病的防治提供了理论参考。研究发现，供试杀菌剂的抑菌效果为0.3%四霉素水剂>80%乙蒜素乳油>98%硫酸链霉素原药>20%松脂酸铜水乳剂>70%代森联水分散粒剂>86.2%氧化亚铜可湿性粉剂>20%乙酸铜可湿性粉剂>6%低聚糖素水剂>20%噻森铜悬浮剂>15%络氨铜水剂>30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂>10%混合氨基酸铜水剂/30%王铜悬浮剂，而27.12%碱式硫酸铜悬浮剂、46%氢氧化铜水分散粒剂、77%硫酸铜钙可湿性粉剂、20%噻菌铜悬浮剂、80%代森锌水分散粒剂、5%大蒜素微乳剂和20%春雷霉素水分散粒剂在浓度≤3000 mg/L时对萝卜黑腐病没有抑菌效果；仅0.3%四霉素水剂和80%乙蒜素乳油对病原的抑菌效果优于98%硫酸链霉素原药，可作为硫酸链霉素替代药剂用于萝卜黑腐病防治。本研究只进行了室内生物活性测定，还有待进一步开展田间药剂验证试验从多方面研究，以确定其科学使用技术，确保萝卜的安全生产。