棉花组培苗高效移栽驯化技术的研究

葛玉君，巩娜，杨建峰，杨敏，刘政，李相敢

（科稷达隆（北京）生物技术有限公司，北京 102206）

0 引言

棉花作为国内重要的经济作物和纤维作物，在国民经济中占有十分重要的地位[1]。其产量虽然在全球名列前茅，但消费量大于产量，出现供不应求局面，呈现贸易逆差状态[2]。常规育种对中国棉花产业的发展已做出了卓越的贡献[3-4]，但近年来，常规育种在解决棉花抗黄萎病、抗虫、纤维品质改良、抗旱等方面遇到了巨大的挑战。而生物技术育种可以通过直接或间接转化手段，有目的地向棉花体内引入控制性状遗传的优良基因，实现生物性状的定向改变[5]，从而提高棉花产量[6]，改良纤维品质[7]，增强植株抗虫[8,9]、抗除草剂[10]、抗病能力[11]和抗逆性[12]。随着生物技术育种的快速发展[13]和应用[14]，通过棉花组织培养和基因编辑技术获得的再生植株越来越多[15-17]，但整个棉花遗传转化过程从农杆菌共培养开始，到获得完整再生幼苗需8～12个月，历时较长，因此获得的转基因棉花再生幼苗尤为珍贵。保证转基因棉花再生幼苗的高存活率，也是棉花遗传转化后续过程中极为重要的环节。与水稻、玉米等作物相比，棉花组培幼苗的根系弱，大多发育不良，表现为无根苗、褐根苗和畸形苗（如丛生苗）等，根系正常的再生植株移栽至土壤或蛭石中，成活率极低（通常只有50%）。所以再生组培幼苗移栽前需经过驯化炼苗、移栽基质选择等繁琐过程，移栽方法不易掌握，移栽成活率低且不稳定，生长缓慢，极大地限制了棉花遗传改良技术的应用[18-20]。

将材料从离体条件转移到温室或田间环境中，大量的植物无法存活。与离体条件相比，温室大田的相对湿度、光照和培养基质等环境显著不同。在这些过程中最关键的技术是使组培幼苗逐渐由无菌向有菌方向，由高温高湿条件向常规条件过渡，稍不注意就会使转基因组培幼苗死亡。然而，任何遗传转化苗或组织培养苗都必须要从组织培养容器转移到离体环境条件中繁殖。近年来，棉花组培苗都是通过嫁接方式进行移栽[21]，但嫁接方法需要专业人员，且周期长，过程复杂，幼苗缓苗期长，成活率平均能达到70%～90%[22]。即使成活率高，其需要特殊的环境条件、炼苗的时间长，且需要培养砧木、占用人力物力[23-24]。因此，棉花组培苗高效简单的驯化技术仍有待深入系统研究，完善的棉花组培苗驯化技术体系也有待建立。

针对上述现有技术中存在的问题，笔者探讨棉花组培苗发育状况、环境条件、培养基质和驯化方法等因素对移栽成活率的影响，以期解决棉花组培幼苗直接移栽不易成活的技术难题，不需要培养嫁接砧木，简化炼苗程序，降低成本，提供一种高效可重复的棉花组培苗移栽驯化技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料是以棉花品种‘新陆早45’的下胚轴和茎尖为组织培养或转化的外植体，通过再生途径获得组培苗。取不同类型的组培苗作为移栽体进行研究。以珍珠岩、蛭石、草炭和花卉营养土作为育苗基质进行比较研究。

1.2 试验方法

试验于2021年1月—2022年5月在科稷达隆北京温室进行。供试材料采用盆栽，盆上口径9 cm、下口径6.5 cm、高6 cm，内装育苗基质。光照长度为14 h（19:00—次日5:00置于黑暗中），植株顶端人工光源光量子通量为200 μmol/(m2·s)，平均温度26℃，湿度50%～60%。

1.2.1 保湿处理选取根系完整（平均根长1～2 cm）、生长势良好的组培苗（带有1～2绿叶），移栽到珍珠岩:蛭石=1:1（体积比）、1/2MS 营养液的基质(S3)中，幼苗分别使用3种方法驯化。T1不做任何保湿处理，室内培养20 d调查幼苗的生长状况；T2将移栽组培苗的表面喷洒稀释600倍的新高脂膜（保湿透光，植物表面保护助剂，粉剂，40 g，陕西省渭南高新区促花万科技有限公司创制），然后室内培养20 d调查幼苗的生长状况；T3 是使用带孔透明的塑料罩，保湿14 d，待组培苗有至少1片新生绿叶后，将保湿薄膜去掉，然后室内生长7 d调查幼苗的生长状况。

1.2.2 基质处理通过长期的经验和文献[25-29]查阅，选取3 种配比的栽培基质。将根系完整（平均根长1～2 cm）、生长势良好的组培苗（带有1～2绿叶）分别移栽到3 种栽培基质上。基质S1 是温室种植常用的花卉营养土，浇水；基质S2是KLASMA草炭土，浇水；基质S3 是珍珠岩:蛭石=1:1（体积比），1/2MS 营养液（Duchefa Biochemie 品牌的植物培养基固体粉末，1900 mg/L的硝酸钾，180.54mg/L硫酸镁，332.02 mg/L氯化钙，170 mg/L 磷酸二氢钾，1650 mg/L 硝酸铵）替代水。移栽后，用带孔带孔透明的塑料罩保湿。每个处理10株，3次重复，20 d后调查幼苗的生长状况，3种基质均不需要灭菌。

1.2.3 组培幼苗根系的分级组培苗按照根系长短分为5级（图1）。A级是根长大于2 cm；B级是根长0.5～2.0 cm；C级是根刚露白；D级是无根，但组织块健康无腐烂；E级是无根，但组织块为黑色或腐烂长霉。将不同根系级别的棉花组培苗分别移栽到栽培基质S3上，用带孔透明的塑料罩保湿。每个处理10株，3次重复，20 d后调查幼苗的生长状况。

图1 不同根系类型的棉花组培苗

1.2.4 生根处理选取至少1 片绿色叶子的无根组培苗，采用2种生根方式。R1是组培苗直接在组培瓶中生根，将带有1～2 片绿色叶生长良好的组培苗转接到生根培养基上，培养温度28℃，培养至生根后再移栽到温室；R2 是将长到1～2 叶的组培苗从皿中取出，沾上生根剂后直接栽入温室育苗床上。

1.3 统计分析

对原始数据进行标准化或归一化处理，经过Microsoft Excel 2021 进行数据的整理转换以后，用PASW Statistics 18(formerly SPSS Statistics)软件进行方差分析与多重比较。

2 结果与分析

2.1 湿度对棉花组培苗成活率的影响

湿度直接影响棉花移栽的成活。从表1 可以看出，不同保湿处理方法最高成活率可达100%，最低50%。在T1处理下，移栽后的组培苗直接裸露在温室的大环境中，叶片容易萎蔫，根系和地上部分植株生长缓慢，并且叶片失水极易造成组培苗死亡，驯化成活率只有50%。T2处理为了简化操作，同时节省塑料保湿杯的成本，使用一种新技术生产的新高脂膜喷洒保湿，移栽后的组培苗直接放置于温室的大环境中，20 d 后统计平均苗高为12.63 cm、根长7.12 cm、叶片4.20片，较T1 处理有显著改善，幼苗的成活率达93%。而T3是采用带孔透明的塑料罩模式进行保湿处理，植株缓苗快，迅速生长，20 d 后平均新生叶片4.55 片、苗高19.94 cm，平均根长可达到10.14 cm，植株成活高达100%。

表1 保湿处理对棉花组培苗炼苗的影响

2.2 基质对棉花组培苗成活率的影响

适合于驯化棉花的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力。由表2 可知，S1 基质在栽培过程中易板结，不易扎根并且扎根慢，平均根长仅有4.88 cm；新生叶片少，平均新生叶2.6片，成活率仅有80%。S2基质透气性好，易扎根，平均根长9.8 cm，新生叶片较多，平均4.33片叶，但在组培苗逐渐长大的过程中，发现草炭土的养分不足导致棉花幼苗叶片成黄绿色。S3 基质保水透气，植物根系扎根快，植株生长健壮茂盛，平均株高达19.94 cm，根长10.14 cm，新生叶片4.53片。S2和S3 基质驯化的棉花幼苗成活率高，但株高、根长和新生叶片数有显著差异，并且S3 使用营养液浇灌，较基质S2 叶色浓绿，植株健壮，成活率达到100%，能够全部成活。

表2 基质对棉花组培苗炼苗的影响

2.3 根系级别对棉花组培幼苗移栽成活率的影响

由表3可知，A级和B级根系的组培苗，移栽驯化20 d 后测量幼苗根系总生长量、株高、根系数量最高，二者没有显著差异，驯化后组培幼苗的成活率为100%。C 级根系的组培棉花幼苗驯化后的株高为15.58 cm，根生长量5.70 cm，新叶片数为3.53 片，与A级和B 级根系的组培苗参数相比差异显著，但成活率为100%，并且植株生长健壮，叶色浓绿。无根组培苗最差，幼苗生长慢，20 d后株高仅有3.22 cm，需要重新生根，平均根长为1.04 cm，新生叶片数平均为0.80片，成活率仅为50%。同时无根的幼苗基端组织块健康无腐烂，一般都能成活；但如果基端组织块为黑色，并且下部叶片常有发黄和萎蔫现象发生，这种组培苗成活率极低，可以不考虑移栽。另外，就移栽壮苗标准而言，株高并不是越高越好，幼苗伸长过高可能是徒长所致。综合来看，移栽驯化时，选用新根较长（根长2 cm)，有至少1 片绿色叶子的组培苗移栽效果较好，而根长1.5～4.0 cm 的组培苗也适用于移栽。对于黑根，叶子发黄或者无叶的组培苗移栽成活率很低。

表3 根系类型对棉花组培苗炼苗的影响

2.4 生根方式对无根组培苗移栽成活率的影响

从上述研究中可以发现，无根的组培幼苗成活率最低，所以进一步探讨2 种生根方法对棉花组培苗成活率的影响。从表4 中可以看，同样的温度条件下，棉花组培苗在R1 的生根方式下，露白时间为7～10 d，生根快，根系发育良好，成活率达100%。而R2 方法是把无根的组培苗取出，沾生根剂后移栽到温室的基质中，由于温室湿度变化幅度大，幼苗需要适应外界变化的湿度和移栽基质，生根缓慢，需要15～20 d，延长了试验周期，并且成活率明显降低，本试验采用R2 的生根方式驯化的棉花组培幼苗成活率仅有60%。

表4 生根方式对棉花无根组培苗成活率的影响

3 结论

棉花组培苗移栽是从无菌到有菌、从高温高湿条件向常规条件过渡的过程。影响移栽成活的关键因素是湿度的控制、移栽基质的选择和组培苗的发育状况等。要提高移栽成活率，必须掌握、控制和利用好这些关键因素，采用组培瓶内诱导生根，根系生长量为1.5～4.0 cm，选择育苗基质为珍珠岩和蛭石体积比1:1混合均匀，移栽后保湿处理炼苗，此方法炼苗成活率达到98%～100%。该技术不需要种植砧木和掌握嫁接技术，技术要求低，可以大规模操作，降低工作量，节约时间和能耗，大幅度提高棉花组培苗成活率。

4 讨论

棉花组培苗移栽是棉花遗传转化和组织培养育苗的重要环节，移栽前对组培苗进行适应性炼苗，不仅可以帮助幼苗适应外界环境，还可以加快缓苗速度，从而提高移栽成活率。一般而言，组织培养得到的双子叶幼苗从培养基移栽到土壤中后，常常会出现叶片失水而导致组培苗萎蔫死亡的现象。

本试验研究了不同保湿处理对棉花组培苗驯化炼苗效果影响，研究表明不保湿处理植物叶片容易萎蔫，成活率偏低。主要是因为棉花组培苗生长在无菌并封闭的试管或培养瓶中，在这种严格的光温条件下生长，培养瓶内的空气湿度接近于100%[32]，移栽到基质中后，在开放的温室环境中，叶片表面不具备蜡质保护层，表皮毛也没有或极少，极易造成失水萎蔫。在南方，热带雨林气候湿度大，直接移栽可能不是大问题。但是北方干燥的环境条件下，棉花再生植株移栽成活难的问题一直困扰着棉花生物技术商品化的发展。所以移栽的成活关键要素之一是控制好移栽后1周的温湿度和光照条件，刚移栽的试管苗必须保持湿度，避免阳光直射，温度以25～30℃为宜。1周之后逐渐开放小孔，由小到大，直至完全去掉塑料罩。但是使用塑料罩保湿，需要适时调整罩口的开度，遇到批量化操作管理会增加人力和物力。笔者在研究中发现一种新兴的新高脂膜物质可以起到保湿作用，是以高级脂肪酸与多种化合物科学复配，采用特色科研新工艺合成的一种可湿性粉剂。喷到棉花组培幼苗表面后，形成一层超薄的保护膜紧贴植物体，不影响作物吸水透气透光，而且能够减少叶片表面的水分蒸发。喷洒移栽后的组培苗，直接放置于温室的大环境中，幼苗的成活率达93%。

王伟等[30]认为使用无菌蛭石并在光照培养箱中进行炼苗的转基因植株成活率相对更低，其原因在于蛭石作为培养基质，其湿度不便控制，过干幼苗萎蔫，过湿易污染长菌导致根系腐烂。可见组培苗在不同基质中的各项指标不同，最适宜的基质配比并不是由单一因素所决定，而应从多种移栽基质分析研究来判断。不同基质炼苗过程中，因为基质的透气性和营养成分不合适，而使组培苗出现不同程度的萎蔫、根腐、死苗等现象，从而影响其成活率和生长发育。为此，作者选定3种基质配方进行试验结果表明，组培苗在蛭石:珍珠岩=1:1 的基质体积配比效果最好，植株生长高度最佳，并且黄化枯叶数量最少，是棉花组培苗炼化最佳的基质配比。MS或其他的营养液能为组培苗提供充足的营养，使移栽后幼苗保证足够的营养。而单纯的营养土虽然土壤养分足够，但由于其透水、透气性较差，往往会影响棉花的移栽成活率。进口草炭虽然能增加一定的透气性，但保水性差，营养物质供应不足，会导致叶片发黄，以致后期植株生长矮小缓慢。可见在驯化过程中基质的通透性、保水性以及营养物质等对组培苗的生理指标和正常生长发育至关重要。因此，在基质中加入一定比例保水性、透气性良好的无机基质（珍珠岩、蛭石等），同时使用营养液浇灌确保足够的养分，可大大提高其移栽成活率。郝会君等[31]在半夏组培苗炼苗技术研究中也得到了相似的结果。在炼苗过程中偶尔会出现溶液长青苔的现象，可清洗炼苗盒后重新浇灌营养液，并不影响棉花苗生长。如棉花组培苗在培养罐中已经长菌，可以使用0.1%多菌灵溶液喷洒炼苗盒，浸泡组培苗3～5 s，可有效防止霉病传染并预防根腐现象的发生。如组培苗在驯化过程中，有生虫现象，可以挂黄板或蓝板进行物理防治，此时不建议大剂量的使用农药。一般驯化14 d后可使用化学防控。

炼苗的成活率不仅与周围的环境条件、土壤基质有关，而且和其自身的生长发育状况有关。王清连等[32]发现诱导获得大量新鲜不定根并具有3～5片叶的壮苗易移栽成活，但不同棉花组培幼苗根系长短对移栽成活率和棉花生长状态的研究鲜有报道。本研究结果发现，一般移栽时，根、茎、叶完整容易成活，但棉花组培苗的成活主要取决于不规则绿色团块组织或新生的根，只要有新生的小块茎或白色的根及1片以上绿色的新叶，使用本研究的方法移栽后均可成活，后续在批量操作实验中验证其成活率均在98%以上。另外，就移栽壮苗标准而言，株高并不是越高越好，幼苗伸长过高可能是徒长所致。综合来看，移栽驯化时，选择根长在1.5～4.0 cm左右操作方便，成活率高，根系发达，幼苗生长健壮，成苗快；取无根或是块茎黑色的组培苗炼苗，根系发新根困难，幼苗成活率低；取根长大于4 cm的组培苗炼苗，幼苗在瓶内生长状况良好，根系发达、相互交错，开瓶炼苗洗去培养基时，容易造成根系损伤，不易彻底洗尽根系附着的培养基，人工操作耗时较多，但幼苗成活率不受影响。

对于无根或块茎黑色的组培苗炼苗，根系发新根困难，本研究使用了2种方法比较研究，发现棉花组培苗在培养罐内生根快，根系发育良好，成活率达100%。而使用体外生根粉处理再生苗，移栽后也能拯救60%的无根幼苗。棉花遗传转化的再生组培幼苗定植困难，可能受到各方面因素的影响，只有通过对环境、培养基质、幼苗状态及其各生长时期等状况的充分研究，才能更深刻了解影响棉花组培苗生长的关键因素，这些有待进一步研究，以改善棉花组培高效再生体系，缩短生长时期，提高组培苗的成活率和结铃率。