FGF23对支气管上皮细胞生长、免疫平衡和上皮间充质转化的影响*

张舒晨 杨旭东 李丹丹 侯新芳 何喜宁

(1.陕西省康复医院儿童康复科,陕西 西安 710065;2.西安交通大学基础医学院,陕西 西安 710061)

支气管哮喘作为一种发病率较高的慢性非传染性疾病,严重危害人类健康。支气管哮喘的病理特征主要表现为气道的炎症、重塑和高反应性[1-2]。其中,气道重塑在支气管哮喘发生过程中的作用不容忽视。在气道重塑过程中,气道上皮屏障受损、上皮细胞黏附减少、上皮细胞向肌纤维母细胞分化。上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是气道重塑过程中一个复杂的重编程过程,为上皮细胞提供间质表型。EMT的发生是一种多基因调控的生物学过程,其通过几种不同的途径发生,在器官发生、组织修复、纤维化、肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用。EMT的发生涉及上皮标志物(E-cadherin)的丢失和间质细胞标志物(N-cadherin、α-SMA和vimentin)的增加。TGF-β1在哮喘患者血清中高表达,并且与气道重塑密切相关[3]。TGF-β1可诱导支气管上皮细胞发生EMT,从而加重气道重塑[4]。因此,抑制EMT是减轻气道重塑的关键。

成纤维细胞生长因子23(Recombinant fibroblast growth factor 23,FGF23)属于成纤维细胞生长因子(FGFs)超家族成员,主要通过与成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor,FGFR)/Klotho复合物结合来发挥生物学功能[5]。现有研究证实,FGF23通过激活FGFR4诱导心肌细胞肥大生长和增加肝细胞炎性细胞因子的产生[6]。另外,慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)患者血浆中FGF23水平显著升高,香烟烟雾通过下调Klotho基因和激活气道上皮中的FGFR4诱导COPD患者的气道炎症,该研究认为抑制FGF23或FGFR4可能是针对COPD的一种新的抗炎策略[7]。本课题组前期研究中也发现哮喘患者支气管肺泡灌洗液中FGF23水平升高。基于上述研究背景,推测FGF23可能参与了哮喘的气道重塑及EMT。因此,本研究以人支气管上皮细胞16HBE为研究对象,旨在揭示FGF23对支气管上皮细胞生长和EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂 胎牛血清和RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司,青霉素和链霉素购自美国Gibco公司,Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司,重组TGF-β1购自美国R&D公司,IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10 ELISA试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司,RIPA裂解缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司,BCA蛋白质测定试剂盒、SDS-PAGE、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和TRIzol试剂购自碧云天生物技术研究所,PVDF膜购自美国Millipore公司,增强型化学发光试剂购自美国Thermo fisher公司,MMLV反转录酶购自美国Promega公司,SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司,Triton X-100购自大连美仑生物技术有限公司。本研究中所用的抗体均购自英国Abcam。

1.1.2 实验细胞及培养 人支气管上皮细胞16HBE购自美国ATCC公司,培养在含8%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中,培养条件为37 ℃和5% CO2。

1.2 方法

1.2.1 16HBE细胞转染 委托上海吉凯基因化学技术有限公司合成FGF23-shRNA重组质粒及shRNA阴性对照质粒(NC-shRNA),使用Lipofectamine 3000转染试剂对16HBE细胞进行转染。转染前1天将16HBE细胞以每孔1×105个细胞接种于500 μL不含抗生素的培养基中,用50 μL无血清培养基稀释20 pmol NC-shRNA或FGF23-shRNA,用50 μL无血清培养基稀释1 μL的Lipofectamine 3000。将上述稀释液混合制备转染液,轻轻混匀,室温放置20 min,终体积为100 μL,每孔细胞中加入100 μL转染液,轻轻摇匀,37 ℃下转染48 h。

1.2.2 细胞分组和处理 将16HBE细胞分为对照组、NC-shRNA组、FGF23-shRNA组、TGF-β1组、NC-shRNA+TGF-β1组和FGF23-shRNA+TGF-β1组。对照组和TGF-β1组细胞不进行转染,其他组细胞按照“1.2.1”所述方法进行转染。转染后,将各组16HBE细胞按照2 000个/孔(100 μL)的密度接种在96孔板中,对照组、NC-shRNA组和FGF23-shRNA组16HBE细胞用完全培养基正常培养,TGF-β1组、NC-shRNA+TGF-β1组和FGF23-shRNA+TGF-β1组16HBE细胞转染后分别用含有10 ng/mL的TGF-β1的完全培养基培养48 h。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖 16HBE细胞转染及TGF-β1处理48 h后,去除培养基,加入10 μL的CCK-8试剂和100 μL无血清培养基,37 ℃和5% CO2下孵育4 h。用BioTek微板分光光度计检测450 nm处的吸光度。

1.2.4 ELISA试剂盒检测16HBE细胞上清液中炎症因子 16HBE细胞转染及TGF-β1处理48 h后,收集各组细胞上清,4 ℃下以500 r/min离心10 min,取上清液。按说明书检测IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平。

1.2.5 Western blot检测16HBE细胞中FGF23、Klotho、FGFR4、E-cadherin和α-SMA的蛋白表达水平 将各组16HBE细胞用RIPA裂解缓冲液裂解,裂解物在4 ℃下以15000 r/min离心15 min。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白质。样品经10%的SDS-PAGE电泳分离并电转移到PVDF膜,采用TBST配制的5%脱脂牛奶封闭处理2 h后,将膜与一抗FGF23(1：1 000)、FGFR4(1：1 000)、Klotho(1：1 000)、E-cadherin(1：3 000)、α-SMA(1：3 000)和β-actin(1：5 000)于4 ℃过夜孵育。然后与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1：3 000)室温孵育2 h。使用增强型化学发光试剂显影,β-actin作为内参蛋白。

1.2.6 qRT-PCR检测16HBE细胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA表达 使用TRIzol试剂提取16HBE细胞中总RNA。使用分光光度计检测260 nm和280 nm处的光密度比,并使用随机引物和MMLV反转录酶将RNA反转录为cDNA。使用ABI PRISM 7500实时PCR系统和SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒对PCR扩增反应。GAPDH作为内参,通过2-ΔΔCT确定目标mRNA水平。引物序列如下：FGF23,正向：5′-GGCCTGATCCACCTGTACACA-3′,反向：5′-ACCACAAAGCCAGCATCCTCT-3′;FGFR4,正向：5′-GTGCTGCCAGAGGAAGACCT-3′,反向：5′-CAGGAGCACAAGCAGAACCA-3′;Klotho,正向：5′-TGTGACAGCCAATGGAATCG-3′,反向：5′-GGTTGATGTCGTCCAACACG-3′;β-actin,正向：5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′,反向：5′-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3′。

1.2.7 免疫荧光染色检测16HBE细胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达 16HBE细胞转染及TGF-β1处理48 h后,接种在盖玻片上用PBS清洗3次,室温下用4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗涤1次,0.5%的Triton X-100处理10 min,PBS洗涤3次,5%牛血清白蛋白孵育30 min。然后将细胞与一抗E-cadherin(1：500)和N-cadherin(1：500)在4 ℃下孵育过夜,再与Alexa Fluor 647标记的羊抗兔IgG二抗(1：500稀释)在室温黑暗中孵育1 h。细胞核用DAPI染色15 min。最后在荧光显微镜下成像。

2 结果

2.1 16HBE细胞的转染效率验证 对16HBE细胞转染NC-shRNA或FGF23-shRNA后,各组细胞中FGF23的mRNA和蛋白表达水平检测结果显示,与对照组相比,FGF23-shRNA组的mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。见图1。

图1 各组16HBE细胞中FGF23的mRNA和蛋白的表达水平

2.2 FGF23对TGF-β1诱导的16HBE细胞增殖的影响 对16HBE细胞转染NC-shRNA或FGF23-shRNA,以及TGF-β1处理48 h后,各组16HBE细胞的增殖能力检测结果显示,与对照组相比,FGF23-shRNA组细胞的OD450nm值降低,TGF-β1组OD450nm值升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组细胞的OD450nm值降低(P<0.05)。见图2。

图2 CCK-8检测各组16HBE细胞的增殖情况

2.3 FGF23对TGF-β1诱导的16HBE细胞上清液中炎症因子的影响 各组16HBE细胞上清液中炎症因子水平检测结果显示,与对照组相比,FGF23-shRNA组细胞上清液中IFN-γ和IL-10水平升高,IL-4和IL-17水平降低(P<0.05)。与对照组相比,TGF-β1组细胞上清液中IFN-γ水平降低,IL-4、IL-17和IL-10水平升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组细胞上清液中IFN-γ和IL-10水平升高,IL-4和IL-17水平降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组16HBE细胞上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平pg/mL)

2.4 FGF23对TGF-β1诱导的16HBE细胞EMT的影响 各组16HBE细胞中E-cadherin和α-SMA的蛋白表达水平检测结果显示,与对照组相比,FGF23-shRNA组细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高,α-SMA水平降低(P<0.05);与对照组相比,TGF-β1组细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低,α-SMA水平升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高,α-SMA水平降低(P<0.05),见图3。各组16HBE细胞中E-cadherin和N-cadherin的相对荧光强度结果显示,与对照组相比,FGF23-shRNA组细胞中E-cadherin相对荧光强度升高,N-cadherin相对荧光强度降低(P<0.05);与对照组相比,TGF-β1组细胞中E-cadherin相对荧光强度降低,N-cadherin相对荧光强度升高(P<0.05);与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组细胞中E-cadherin相对荧光强度升高,N-cadherin相对荧光强度降低(P<0.05),见图4。

图3 Western blot检测各组16HBE细胞中E-cadherin和α-SMA的蛋白表达水平

图4 免疫荧光染色检测各组16HBE细胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达

2.5 FGF23对TGF-β1诱导的16HBE细胞中FGF23-Klotho-FGFR4信号的影响 各组16HBE细胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA和蛋白表达水平检测结果显示,与对照组相比,FGF23-shRNA组细胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相对表达水平均降低,Klotho的mRNA和蛋白的相对表达水平均升高(P<0.05)。与对照组相比,TGF-β1组细胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相对表达水平均升高,Klotho的mRNA和蛋白的相对表达水平均降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组细胞中FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白的相对表达水平均降低,Klotho的mRNA和蛋白的相对表达水平均升高(P<0.05)。见图5、6。

图5 qRT-PCR检测各组16HBE细胞中FGF23、Klotho和FGFR4的mRNA表达水平

图6 Western blot检测各组16HBE细胞中FGF23、Klotho、FGFR4的蛋白表达水平

3 讨论

支气管哮喘属于一种气道高反应性疾病,支气管上皮细胞是机体隔绝外界环境的第一道屏障[8]。研究表明,多种外源性刺激可引起支气管上皮细胞中具有不同生物学功能的基因发生差异表达、释放炎症信号,进而引起辅助性T(Th)细胞的活化、免疫失衡以及EMT的发生[9]。因此,本研究以16HBE细胞作为研究对象,观察FGF23对16HBE细胞生长、免疫平衡以及EMT的影响。

FGF23是FGFs超家族成员,具有调控机体胆汁酸平衡、维持稳态、调节葡萄糖和脂质代谢等作用,FGF23主要通过与Klotho(FGF23的共同受体)及其受体FGFR结合来调节生物学效应[10]。Krick等[7]研究表明,COPD患者血浆FGF23水平升高,FGF23可通过激活FGFR4增加人支气管上皮细胞中IL-1β的释放,从而加剧炎症反应,导致免疫失衡。本研究前期实验发现哮喘患者支气管肺泡灌洗液中FGF23水平升高。研究表明,支气管上皮细胞再经香烟烟雾等外界刺激后会发生异常增殖,以及促炎细胞因子的过量分泌[11]。此外,TGF-β1可诱导支气管上皮细胞发生EMT[4]。为了进一步研究FGF23在哮喘发生过程中发挥的作用,本研究观察下调FGF23对TGF-β1诱导的16HBE细胞增殖的影响,结果表明,TGF-β1诱导了16HBE细胞的异常增殖,而下调FGF23则可抑制16HBE细胞的增殖。目前,也有文献表明FGF23可促进胃癌细胞的增殖[12]。综上提示,FGF23具有促进肺组织细胞增殖的作用,而抑制FGF23则可能是防止气道重塑的一种策略。

当受到外界刺激后,支气管上皮细胞会分泌白介素、趋化因子和生长因子等一系列细胞因子,这些细胞因子可传递炎症信号、募集多种炎症细胞,从而引起机体免疫失衡,加重哮喘的严重程度[13]。在哮喘的发生发展中,Th细胞相关免疫功能紊乱起着重要作用。Th细胞分为4种亚型：分泌IFN-γ的Th1细胞,分泌IL-4的Th2细胞,分泌IL-17的Th17细胞,以及分泌IL-10的Treg细胞[14]。目前,专家普遍认为Th1/Th2和Treg/Th17的失衡是导致哮喘加重的关键因素。Th1细胞可以抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的分化和增殖,Th2型细胞因子可阻止Th1细胞产生细胞因子[15-16]。IFN-γ是促进Th0向Th1分化的关键细胞因子,而IL-4是诱导Th2分化的关键因子,可推动嗜酸性粒细胞在哮喘患者肺部的聚集[17]。IL-17和IL-10在功能上相互拮抗,IL-17可募集中性粒细胞并吸引嗜酸性粒细胞,进一步加剧哮喘发作[18]。据报道,哮喘患者血清中IL-4和IL-17水平升高,而IFN-γ和IL-10降低[19]。本研究结果显示,下调FGF23表达升高了TGF-β1诱导的16HBE细胞上清液中IFN-γ和IL-10的水平,而降低了IL-4和IL-17水平。这些结果表明FGF23可能通过改善Th1/Th2和Treg/Th17失衡来调节机体免疫,从而抑制哮喘相关炎症。

气道重塑是支气管哮喘的关键病理特征,在气道重塑过程中,支气管上皮细胞通过发生EMT来诱发气道重塑[20]。EMT表现为E-cadherin等上皮标记物的丢失,以及α-SMA和N-cadherin等间充质标记物的表达。本研究结果显示,下调FGF23表达升高了TGF-β1诱导的16HBE细胞中E-cadherin的蛋白表达水平,并抑制了α-SMA和N-cadherin的表达,从而抑制16HBE细胞的EMT。

已有研究表明,COPD患者气道中Klotho表达减少[21],Klotho作为协同因子与FGFR结合形成FGFR-Klotho复合物[22],启动FGF23信号下游分子FGFR4,在缺少Klotho的情况下,FGF23可以激活FGFR4并诱导心肌细胞肥大生长和增加肝细胞炎性细胞因子的产生[6]。此外,Klotho基因敲除的小鼠气道炎症加剧,肺内FGFR4表达增加,而Klotho基因的过度表达则可减轻气道炎症[7]。本研究结果表明,下调FGF23抑制了TGF-β1诱导的16HBE细胞中FGFR4的表达,并促进了Klotho的表达。这些结果提示通过抑制FGF23-Klotho-FGFR4信号通路可能是治疗哮喘的一种有效途径。

4 结论

下调FGF23抑制了TGF-β1诱导的16HBE细胞的生长和EMT,并改纠正了Th1/Th2和Treg/Th17的失衡。FGF23-Klotho-FGFR4信号可能是哮喘治疗的一种分子靶标。