禽呼肠孤病毒σC蛋白重组腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞增殖的影响

黄莉，周艾玲，李雨桐，王紫薇，徐昊，钱明明，周崇

广西中医药大学，广西 南宁 530200

近年来，全球癌症发病率和死亡率迅速上升，癌症已成为大多数国家人群死亡的主要病因，也给全球带来沉重的经济负担。作为一种新兴的肿瘤治疗手段，溶瘤病毒以其独有的靶向杀伤肿瘤而不破坏正常组织的作用特性成为现今医学研究的热点，并广泛应用于临床试验［1］。

禽呼肠孤病毒（avian reovirus，ARV）属呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属RNA 病毒，是一种天然的溶瘤病毒，已被证明具有良好的溶瘤效应［2-3］。σC蛋白是ARV的重要结构蛋白，位于病毒的外衣壳，由病毒S1基因的第3个开放阅读框编码，基因碱基数为980 bp，蛋白相对分子质量约35 000［4］。σC 蛋白是ARV 感染引起细胞凋亡的重要蛋白，且具有良好的免疫原性，可诱导宿主产生特异性中和抗体［5-6］。但σC蛋白是否参与ARV 的溶瘤效应，目前尚不清楚。因此，本研究利用同源重组技术构建表达ARV σC 蛋白的重组腺病毒载体，并分析其对肿瘤细胞生长的影响，探讨ARV 溶瘤效应的分子机制，为研发新型抗肿瘤生物制剂提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 载体及细胞 穿梭载体pShuttle-CMV 购自美国赛默飞世尔科技公司；BJ5183（pAdessy-1）感受态细胞购自武汉博士德生物工程有限公司；HEK293细胞购自中科院上海细胞库；质粒pMD20-ARVσC、肝癌细胞SMMC7721、大肠埃希菌DH5α 感受态细胞由广西中医药科学实验中心实验室保存并提供。

1.2 主要试剂及仪器 DMEM、胎牛血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY（H+L）、Lipofectamine2000和MultiskanSkyHigh 全波长酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司；限制性内切酶PacⅠ、PmeⅠ购自美国New England Biolabs 公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自德国QIAGEN 公司；EasyGeno 重组克隆试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR®HS DNA Polymerase 购自日本TaKaRa 公司；ARV Ag ELISA 试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司；RIPA 高效细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；Western blot 相关试剂购自上海雅酶生物科技有限公司；ARV阳性血清由本实验室保存并提供；5-FU购自美国MedChemExpress公司。

1.3 目的基因的扩增及重组穿梭载体的构建 按照EasyGeno 重组克隆试剂盒说明书进行操作。根据GenBank 上登录的ARVσC基因（AF330703）及穿梭载体pShuttle-CMV 序列（AF334399），在σC基因的5′端添加KpnⅠ酶切位点和载体上游末端重叠序列，3′端添加HindⅢ酶切位点和载体下游末端重叠序列，设计ARVσC基因上下游引物［σCF：5′-ctagagatctggtaccatggcgggtctcaatccatcgc-3′（斜体部分为KpnⅠ酶切位点），σCR：5′-gatatcttatctagaagcttttaggtgtcgatgccggtacgc-3′（斜体部分为HindⅢ酶切位点），扩增片段大小为980 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成］。以质粒pMD20-ARVσC携带的σC基因为模板，利用引物σCF 和σCR 进行PCR 扩增。反应条件：95 ℃3 min；95 ℃30 s，60 ℃1 min，72 ℃1 min，共35 个循环；72 ℃7 min。回收纯化PCR 产物，利用同源重组技术连接至载体pShuttle-CMV，转化大肠埃希菌DH5α 感受态细胞，涂布含50 μg／mL卡那霉素的LB平板，37 ℃过夜培养；挑选单菌落，利用引物σCF 和σCR 进行PCR 检测。将阳性单菌落接种至5 mL含50 μg／mL卡那霉素的LB培养液中，37 ℃，180 r／min 振摇过夜，抽提质粒进行双酶切（HindⅢ／KpnⅠ）鉴定，获得重组穿梭载体pShuttleσC。将鉴定正确的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.4 重组腺病毒载体的构建 利用PmeⅠ酶切获得线性化pShuttle-σC，42 ℃热激转化BJ5183（pAdessy-1）感受态细胞，涂布含50 μg／mL 卡那霉素的LB 固体培养基平板，37 ℃过夜培养；挑选较小菌落，作为候选重组载体pAd-σC阳性克隆，利用引物σCF 和σCR进行PCR鉴定。

1.5 重组腺病毒的组装及滴度检测 将重组腺病毒载体pAd-σC转化大肠埃希菌DH5α 感受态细胞，利用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，经PacⅠ酶切线性化处理，利用脂质体Lipofectamine 2000 转染HEK293细胞，置37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养。每日观察细胞生长状态，持续10～15 d。待大部分细胞出现典型的细胞病变，如肿胀、变圆、坏死等，且约50%细胞出现脱壁漂浮，提示重组腺病毒组装成功。收集细胞及上清，于-80 ℃低温和37 ℃水浴反复冻融3 次，11 000×g离心，收集上清，作为重组腺病毒第1 代病毒液Ad-σC。连续盲传HEK293 细胞，至出现细胞病变时间稳定，收集Ad-σC病毒液进行效价滴定（TCID50）。将HEK293细胞按106个／mL接种96 孔细胞板，100 μL／孔，待细胞长成单层，用无菌1 × PBS 10 倍系列稀释病毒液（10-1～10-10），每个稀释度接种8 孔，加入病毒稀释液，100 μL／孔，37 ℃吸附1 h；弃病毒液，加入含2%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃继续培养；逐日观察，至细胞病变不再进展。根据Reed-Muench 公式计算病毒效价（TCID50）。试验设pAdessy-1 空载体组，在HEK293 细胞组装，获得空载体腺病毒Ad，并检测其病毒滴度。

1.6 重组腺病毒Ad-σC 在肿瘤细胞中的表达验证将Ad-σC 病毒液感染SMMC7721 细胞48 h 后，收集细胞，提取蛋白，经10% SDS-PAGE 分离后，转移至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h；加入8 倍稀释的ARV 阳性血清，4 ℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY（H + L）（1∶1 000 稀释），37 ℃振荡孵育1.5 h；ECL 显影拍照。同时设空载体组的细胞蛋白作为阴性对照，未感染细胞蛋白作为空白对照。收集细胞上清，检测ARV含量，以验证σC表达，具体操作按ARV Ag ELISA 检测试剂盒说明书进行。

1.7 重组腺病毒Ad-σC 对肿瘤细胞增殖影响的检测 收集对数生长期SMMC7721 细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为2 × 105个／mL，接种至96 孔培养板，100 μL／孔，置37 ℃，5% CO2细胞培养箱培养。设阳性对照（50 μg／mL 5-FU）、空白对照、Ad、Ad-σC 组，分别培养24、48 和72 h 后，加入CCK-8 溶液，10 μL／孔，继续孵育1 h；酶标仪检测450 nm 波长处的A值，计算细胞存活率。

1.8 统计学分析 采用SPSS 26.0 软件处理数据，实验数据以均值± 标准差（x ± s）表示，样本间采用ttest分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 目的基因扩增产物及重组穿梭载体pShuttle-σC的鉴定 ARVσC基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约980 bp的单一条带，见图1。表明σC基因片段扩增成功。重组穿梭载体pShuttle-σC的阳性菌落PCR及双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约980 bp 处可见特异的单一目的基因条带，后者在约7 500 bp处还可见载体片段条带，见图2和图3。测序结果表明，目的基因序列与GenBank 登录的ARV（AF330703）衣壳蛋白σC基因序列一致。表明重组穿梭载体pShuttle-σC构建正确。

图1 σC基因PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR amplification of σC

图2 重组穿梭载体pShuttle-σC阳性菌落的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of positive colonies of recombinant shuttle vector pShuttle-σC

图3 重组穿梭载体pShuttle-σC 的双酶切（HindⅢ／KpnⅠ）鉴定Fig.3 Restriction map of recombinant shuttle vector pShuttle-σC（HindⅢ／KpnⅠ）

2.2 重组腺病毒载体pAd-σC 的鉴定 pAd-σC的菌落PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，在约980 bp处可见单一的特异条带，见图4。表明目的基因σC已克隆至腺病毒载体pAdeasy-1，成功构建了重组腺病毒载体pAd-σC。

图4 重组腺病毒载体pAd-σC的PCR鉴定Fig.4 PCR identification of recombinant adenovirus vector pAd-σC

2.3 重组腺病毒pAd-σC 的效价 转染后第5 天，可观察到细胞间隙变大，细胞变圆，呈葡萄串样排列，部分细胞萎缩脱落，表明重组腺病毒Ad-σC 组装成功，见图5。10 倍系列稀释病毒液后，感染HEK293细胞，病毒滴度为107.5TCID50／0.1 mL。

2.4 重组腺病毒Ad-σC 在肿瘤细胞中的表达 Westeron blot 分析显示，在相对分子质量约37 000 处可见特异性条带，大小与目的蛋白相符，而阴性对照未见条带，见图6。ARV Ag ELISA 检测结果显示，AdσC 感染细胞上清A450为0.81 ± 0.06，大于阳性对照Cutoff值（0.24±0.03），表明Ad-σC 已在感染细胞中增殖表达。

图6 Ad-σC在肝癌细胞表达的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of Ad-σC expression in hepatocellular carcinoma cells

2.5 重组腺病毒Ad-σC 对肿瘤细胞增殖的影响CCK-8 试验结果显示，随着反应时间增加，Ad 和AdσC 组感染细胞的活力均明显下降。与Ad 组感染细胞的存活率［24 h：（92.29 ± 5.08）%，48 h：（64.09 ±7.05）%，72 h：（54.39±1.20）%］相比，Ad-σC组感染细胞的存活率［24 h：（85.15±2.21）%，48 h：（36.48±0.89）%，72 h：（24.67±2.57）%］显著降低（t分别为1.403、28.69、6.616，P分别为＞0.05、＜0.05、＜0.05）。见图7。表明重组腺病毒Ad-σC显著抑制SMMC7721细胞的生长，具有较好的抗肿瘤作用。

图7 重组腺病毒Ad-σC 对SMMC7721 细胞生长的抑制作用Fig.7 Inhibition effect of recombinant adenovirus Ad-σC on SMMC7721 cells

3 讨论

随着肿瘤研究的深入和生物技术的发展，以溶瘤病毒为核心的病毒生物学疗法以其高效和低毒性，已成新型治疗肿瘤的生物学手段，是一种非常有前景的治疗途径，为控制肿瘤的发生发展提供了新视角［7-9］。

作为溶瘤病毒治疗的研究平台，ARV 具有许多独特的特性：①人不是ARV 的感染宿主，既不会引起人致病，也可潜在地激活人的免疫系统，尤其是诱导特异性抗肿瘤免疫应答；②ARV 通过融合相关小跨膜蛋白蛋白诱导死亡小体形成，以实现其在肿瘤细胞内的复制及扩散［10-11］。KOZAK 等［3］证实，ARV能在丙型肝炎病毒感染的肝癌细胞中复制，并诱导肝癌细胞形成死亡小体，进而发生凋亡和产生干扰素刺激因子。CAI等［12］则明确了ARV 可显著抑制人HepG2细胞增殖，以及ARV在感染小鼠体内的动态分布，并证实了ARV 对正常宿主无溶瘤效应，具有良好的安全性。因此，深入探讨ARV 溶瘤效应的分子机制，寻找ARV 发挥抑瘤作用的关键蛋白及调控分子，将有助于推进ARV 临床肿瘤治疗试验、研发新型ARV抗肿瘤生物制剂。

研究表明，溶瘤病毒的某些编码蛋白也具有抗肿瘤能力，可选择性抑制或诱导肿瘤细胞凋亡，还可诱导机体对肿瘤细胞产生抗肿瘤免疫，达到杀伤肿瘤细胞的目的［13-14］。H9N2 亚型禽流感病毒NS1A 蛋白可抑制DNA合成，并诱导人肺癌细胞SPC-A1发生凋亡［15］。鸡贫血病毒VP3蛋白已被证实不依赖人肿瘤细胞内p53 和bcl-2 的表达来诱导人肿瘤细胞凋亡，对p53 突变和bcl-2 高表达的肿瘤细胞同样具有杀伤作用，但不能诱导正常细胞发生凋亡［16-17］。鸡新城疫病毒HN 蛋白定位于肿瘤细胞膜上，可上调MHC-Ⅰ表达，增强机体免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用［18］。以上研究结果表明，溶瘤病毒编码蛋白可特异性诱导肿瘤细胞凋亡，具有抗肿瘤作用，展示出良好的肿瘤治疗应用前景。作为ARV 结构蛋白，σC 蛋白通过与宿主细胞表面的特异受体结合，介导对细胞的吸附，启动病毒感染过程［19］。σC 蛋白可通过依赖于p53 的通路诱导细胞凋亡，参与到ARV 的凋亡诱导机制［20］。并且σC 蛋白能刺激机体免疫应答，产生中和性抗体，与宿主细胞真核延伸因子1α1（eukaryotic translation elongation factor 1 alpha1，EEF-1α1）发生互作，激活caspase-9 和caspase-3，介导细胞凋亡发生，进而调控ARV 在宿主细胞内的复制，在ARV 感染及与宿主相互作用过程中发挥重要作用［21-23］。此外，将表达σC 蛋白的质粒直接注射肿瘤内部能够诱导凋亡，抑制劳氏肉瘤病毒引起的鸡纤维肉瘤生长，显示出抗肿瘤效应［2］。本研究中，重组腺病毒Ad-σC 初步显示出对肝癌细胞增殖的抑制作用，为后续其抑瘤作用分子机制的探索提供了实验依据，也预示了其作为抗肿瘤生物制剂的开发潜能。

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，普遍用于基因治疗、基础生命科学研究等领域。重组腺病毒作为溶瘤病毒的媒介物，具有安全性好，转染效率高，能容纳大片段外源基因，感染宿主范围较广，并且病毒滴度高且浓缩储存方便等优点［5］。本研究采用DNA同源重组方法，借助穿梭载体pShuttle，将目的基因ARVσC连接至腺病毒骨架载体pAdeasy-1，成功构建重组腺病毒载体pAd-σC，与其他构建重组腺病毒表达载体的方法相比，步骤少、耗时短、成功率高，不仅避免了重组过程中目的基因发生突变，还可防止野生型病毒的混入，安全性高且结果可靠，为后续抗肿瘤生物制剂的研制奠定了基础。

本研究成功构建了表达ARVσC基因的重组腺病毒Ad-σC，并证实其具有抑制肝癌细胞增殖的作用，为揭示ARV 溶瘤效应的分子机制及进一步研发新型抗肿瘤生物制剂奠定了基础。