血清VNN1及CCN2检测对2～4期慢性肾脏病并发急性肾损伤的预测价值

周洪文,刘健君,刘冬菊,刘小霞,汤跃武

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是世界范围内常见的公共卫生问题,我国成年人群患病率达10.8%[1]。CKD并发急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是在原有CKD基础上由于各种原因导致短期内肾小球滤过率迅速下降的一组临床综合征,为2～4期CKD患者常见的并发症,发病率和病死率较高[2]。CKD并发AKI的早期诊治有助于改善患者临床预后。血管非炎性因子(Vanin 1,VNN1) 属于Vanin蛋白家族成员,属于泛酰巯基乙胺酶,催化水解巯基乙胺水解形成巯基乙胺和泛酸[3]。近年来发现,VNN1能够通过激活RB1表达和磷酸化来诱导肾小管细胞衰老,促进严重肾缺血再灌注损伤后肾纤维化[4]。细胞交流网络因子2(cellular communication network factor 2,CCN2)是血管内皮细胞分泌的有丝分裂原,在软骨细胞增殖和分化、细胞黏附中发挥作用[5]。有研究发现,CCN2能够促进肾小管上皮细胞的氧化应激,加重肾脏缺血再灌注损伤后的脂质过氧化,导致AKI的发生[6]。目前CKD并发AKI患者血清VNN1和CCN2表达及临床意义尚不清楚。本研究通过检测2～4期CKD患者血清VNN1和CCN2水平,分析两者对2～4期CKD患者并发AKI的诊断价值,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年3月—2022年3月重庆医科大学附属第一医院梁平医院肾内科诊治2～4期CKD患者102例为CKD组。再根据CKD患者是否并发AKI,分为AKI亚组28例和非AKI亚组74例。以同期体检的健康者60例为健康对照组,男35例、女25例;年龄44～78 (64.96±6.03)岁;体质量指数19.26～25.41 (22.43±2.85)kg/m2。 AKI亚组CKD分期4期比例高于非AKI亚组,差异有统计学意义(P<0.01)。2亚组性别、年龄、体质量指数、肾脏基础病、高血压史、糖尿病史、冠心病史、三酰甘油、总胆固醇、血红蛋白、血白蛋白、降钙素原、C反应蛋白及白细胞计数之间比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。本研究经医院医学伦理委员会批准通过(MD2020-JK0011),患者及家属知情同意并签署知情同意书。

表1 AKI亚组与非AKI亚组患者临床资料比较

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①CKD诊断符合2002年美国国家肾脏基金会制定的K/DOQI指南中的标准[7],CKD分期为2～4期;②临床资料完整。(2)排除标准:①年龄<18岁或>80岁;②合并自身免疫性疾病、血液系统疾病;③合并恶性肿瘤、急性胃肠炎等疾病或有糖皮质激素用药史等;④合并认知功能障碍或精神疾病者;⑤妊娠、哺乳期女性。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清VNN1和CCN2水平测定:患者入院后次日晨、健康对照组体检时采集空腹外周静脉血5 ml,离心留取上层血清待测。采用酶联免疫吸附实验(双抗体夹心法)测定患者血清VNN1和CCN2水平,实验步骤按照试剂盒说明进行。人VNN1试剂盒购自上海康朗生物科技公司(货号KL-VNN1-Hu);人CCN2试剂盒购自上海赛培森生物科技公司(货号SPS-12657)。根据标准品浓度值及450 nm处的吸光度值绘制标准曲线,计算样品浓度值。

1.3.2 肾疾病指标检测:上述血清通过全自动生化分析仪(型号 2400,西门子公司)检测血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA);留取患者早晨07:00至次日07:00尿液,记录总尿液量,将全部尿液摇匀后取3 ml上机检测24 h尿蛋白定量(24 hUP)。实验试剂均购自上海科华生物工程股份有限公司。

1.3.3 AKI的判定: AKI的诊断符合2012年提高肾脏病整体预后工作组(KDIGO)标准[8],符合以下任意1条即可诊断:48 h血肌酐上升>26.5 μmol/L;1周内血肌酐增至基线的50%;尿量减少<0.5 ml·kg-1·h-1,超过6 h。

2 结 果

2.1 2组血清VNN1、CCN2水平比较 CKD组患者血清VNN1、CCN2水平分别为(40.47±6.18)μg/L、(165.18±36.40)ng/L,明显高于健康对照组(12.14±2.36)μg/L、(82.63±18.25)ng/L(t=34.043、16.383,P均<0.001)。

2.2 2亚组血清VNN1、CCN2水平比较 AKI亚组患者血清VNN1、CCN2水平分别为(59.82±6.30)μg/L、(228.03±37.61)ng/L,明显高于非AKI亚组(33.15±5.88)μg/L、(141.40±35.64)ng/L(t=20.046、10.791,P均<0.001)。

2.3 2亚组肾疾病检查指标比较 AKI亚组血肌酐、血尿酸、血BUN、24 hUP均高于非AKI亚组,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 非AKI亚组与AKI亚组患者肾疾病指标比较

2.4 血清VNN1、CCN2与肾疾病指标的相关性分析 Pearson相关分析结果显示,2～4期CKD患者血清VNN1、CCN2与血肌酐、血尿酸、血BUN、24 hUP均呈正相关(P<0.01),见表3。

表3 血清VNN1、CCN2与2～4期CKD患者肾疾病指标的相关性

2.5 多因素Logistic回归分析影响CKD分期2～4期CKD患者并发AKI的因素 以CKD分期2～4期CKD患者并发AKI为因变量(赋值:是为“1”;否为“0”),以上述结果中P<0.05项目为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示:血肌酐、血BUN、血尿酸、24 hUP、血清VNN1、CCN2升高是影响2～4期CKD患者并发AKI的独立危险因素(P<0.01),见表4。

表4 影响2～4期CKD患者并发AKI的多因素Logistic回归分析

2.6 血清VNN1、CCN2及二者联合预测CKD分期2～4期CKD患者并发AKI的价值 绘制血清VNN1、CCN2及二者联合预测CKD分期2～4期CKD患者并发AKI的价值ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示:血清VNN1、CCN2及二者联合预测CKD分期2～4期CKD患者并发AKI的AUC为0.814、0.822、0.890,二者联合的AUC大于单一指标检测(Z=4.675、4.513,P均<0.001),见表5、图1。

图1 ROC曲线分析血清VNN1、CCN2及二者联合对2～4期CKD患者并发AKI的预测价值Fig.1 ROC curve analysis of serum VNN1, CCN2, and their combined predictive value for AKI in stage 2-4 CKD patients

表5 血清VNN1、CCN2及二者联合预测CKD分期2～4期CKD患者并发AKI的价值

3 讨 论

CKD可造成机体代谢紊乱及各器官系统并发症,导致患者处于AKI易感状态。AKI可使CKD 2～4期患者病程快速进展,患者短期内进入终末期肾病阶段,病死率显著增加。血肌酐、BUN等是目前诊断AKI的重要临床指标,但血肌酐、BUN升高时肾结构或功能障碍已较为严重,另外,年龄、体质量及饮食等因素也会影响血肌酐、BUN水平[9]。深入研究CKD并发AKI的机制,寻找能早期预测AKI发生的血清标志物,具有重要临床意义。

VNN1是一种泛酰巯基乙胺酶,能够分解产生巯基乙胺,参与辅酶A代谢、脂质代谢和氧化应激及炎性反应等病理生理过程,与结肠炎、肾炎及特发性血小板减少性紫癜等疾病关系密切[10]。有学者在大鼠缺血再灌注模型中,通过DNA微阵列分析发现VNN1基因在AKI早期表达显著上调,提示VNN1是肾损伤的潜在生物标志物[11]。本研究中,2～4期CKD患者血清VNN1水平升高,并与肾功能指标呈正相关,提示VNN1参与促进2～4期CKD患者疾病的发生发展。笔者分析,CKD发生时,肾小球和肾间质组织的炎性反应能够激活核因子κB信号通路,核因子κB能够在转录水平上调VNN1的表达水平,而VNN1的高表达进一步促进肾组织氧化应激及炎性反应,加重CKD病情程度[12]。有研究发现,VNN1能够促进肾脏局部组织中白介素1β及白介素6等促炎因子的释放,加重肾小管上皮细胞的炎性反应,促进肾小管上皮细胞的凋亡[10]。另外,VNN1的水解产物巯基乙胺能够促进血管内皮细胞产生活性氧,抑制还原型谷胱甘肽的还原能力,导致血管内皮的氧化应激损伤[13]。本研究中,2～4期CKD并发AKI患者血清VNN1升高更为明显,血清VNN1是影响2～4期CKD并发AKI发生的独立危险因素。笔者分析,VNN1能够加重CKD肾间质炎性反应、氧化应激及细胞衰老,促进AKI的发生。研究表明,VNN1的表达升高能够促进肾近端小管的氧化应激损伤,促进肾小管坏死,导致肾小管上皮细胞刷状边缘微绒毛的坏死脱落,造成肾小管阻塞,导致AKI的发生[14]。另外,CKD患者VNN1的水平升高能够促进肾小管上皮细胞RB1的表达和磷酸化激活,促进肾小管细胞衰老,加重肾缺血再灌注损伤及肾纤维化程度,促进CKD的疾病进展及AKI的发生[4]。因此,VNN1可能是新的评估2～4期CKD患者并发AKI的血清标志物。

CCN2又称为结缔组织生长因子,其作为一种分泌型蛋白,其能与纤维连接蛋白等细胞外基质成分结合,参与调控细胞增殖、凋亡、自噬及免疫炎性反应等多种病理生理过程[15]。研究表明,CCN2的表达升高能够抑制脂肪酸氧化调节因子的活性,导致肾小管上皮细胞中脂质积聚和细胞外基质沉积,促进肾组织中成纤维细胞的增殖,导致肾纤维化[16]。本研究中,2～4期CKD患者血清CCN2水平升高,提示CCN2参与CKD的疾病发生。CCN2的表达受Hippo-YAP通路的激活。研究表明,Hippo-YAP通路的激活能在转录水平上调CCN2的表达,诱导肾小管上皮细胞释放肿瘤坏死因子α、白介素6等促炎细胞因子,导致肾组织损伤[17-18]。另外,血清CCN2水平与2～4期CKD患者肾功能指标有关,提示血清CCN2有助于反映患者肾功能情况。研究表明,对肾脏损伤的反应中,CCN2能够与细胞外基质成分相互作用,激活肾小球和/或肾小管细胞整合素及下游信号通路,引起促炎和促纤维化因子的过度分泌,细胞外基质大量沉积,降解减少,促进肾纤维化及CKD的疾病进展[19]。本研究中,血清CCN2是影响2～4期CKD并发AKI的独立危险因素,提示CCN2可能是新的评估2～4期CKD并发AKI的血清标志物。有研究表明,CCN2是促进CKD并发AKI的主要驱动因素,CCN2能够延长肾脏缺血再灌注损伤后的DNA损伤反应,促进肾小管上皮细胞的氧化应激及细胞衰老,导致AKI的发生,而在抑制CCN2后能够明显减少氧化应激诱导的肾小管上皮细胞的DNA损伤,减少AKI的发生[20]。另有研究证实,应用特异性靶向肽抑制CCN2后,能够抑制肾小管上皮细胞表皮生长因子受体及下游信号传导和转录激活因子3的表达,逆转肾组织炎性反应及细胞外基质蛋白的合成,抑制肾纤维化及AKI的发生[21]。因此,CCN2可能是新的评估2～4期CKD并发AKI的血清指标。

本研究中,2～4期CKD患者并发AKI的发生率为27.45%,这与既往研究结果一致[22-23],表明2～4期CKD患者具有较高的AKI发生率,临床医生应早期识别2～4期CKD并发AKI患者,予以积极诊治,延缓终末期肾病的发生。本研究中, 血清VNN1、CCN2联合对2～4期CKD患者并发AKI具有较高的预测价值,诊断的敏感度和特异度分别为0.902、0.785,提示血清VNN1、CCN2联合能有效评估2～4期CKD患者并发AKI的发生风险,临床医生可根据血清VNN1、CCN2水平对2～4期CKD患者进行相应的预防和治疗,减少AKI的发生。另外,本研究通过多因素分析发现,血肌酐、血BUN、血尿酸、24 h尿蛋白定量也是影响2～4期CKD患者并发AKI的独立危险因素,这与既往研究报道结果一致[24-25]。血肌酐、血BUN是反映CKD患者肾功能的常用指标,血肌酐、血BUN升高提示患者储备能力下降,增加患者感染等因素导致AKI的发生风险。血尿酸是嘌呤降解的产物,血尿酸的升高可通过尿酸晶体沉积于肾小管内,抑制肾脏一氧化氮合酶,促进肾血管收缩,加快CKD的疾病进展,增加AKI的发生风险。24 h尿蛋白定量升高提示CKD患者肾小球滤过和肾小管重吸收能力降低,白蛋白防止肾脏氧化损伤及溶血磷脂酸结合能力下降,促进CKD患者肾功能损伤及AKI的发生。

综上所述, 2～4期CKD患者血清VNN1、CCN2升高,是影响2～4期CKD患者并发AKI的独立危险因素,血清VNN1、CCN2联合对2～4期CKD并发AKI具有较高的预测价值,可作为2～4期CKD患者是否合并AKI的参考指标。本研究尚存在不足。本研究为单中心回顾性研究,且样本量较少,基线资料可能存在一定的偏差,有待今后设计前瞻性多中心临床试验,扩大样本容量进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

周洪文:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;刘健君:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;刘冬菊:进行统计学分析;刘小霞:课题设计,论文撰写;汤跃武:提出研究思路,分析试验数据,论文审核