基于化学计量学对不同产地甘草的质量评价

胡力飞，梅菊，吴涛，石榴花，殷涛，孙代华

1.湖北工业大学生物工程与食品学院（武汉 430068）；2.劲牌持正堂药业有限公司（黄石 435100）；3.劲牌有限公司（黄石 435100）

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草Glycyrrhizɑ inflɑtɑBat.或光果甘草Glycyrrhiza glabraL.的干燥根和根茎，始载于《神农本草经》，有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。甘草在我国药用历史悠久，有“十方九草”之说，为常用的药食同源中药品种之一[1-4]。甘草含有三萜皂苷类、黄酮类、多糖等多种活性成分，具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等多种功能[5-10]；甘草苷、甘草酸为《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）中的指标成分[1]，其中甘草酸及其盐类也是重要的药品和天然甜味剂原料[11-12]。甘草因其功能特性，在国内外被广泛用于食品、药品、化妆品、烟草等行业[13]。

甘草在我国主要分布于甘肃、内蒙古、新疆等地，此试验根据《中国药典》甘草项下要求，对甘肃（兰州、白银、武威、金昌、酒泉）、内蒙古（鄂尔多斯）、新疆（阿克苏、和田、巴音郭楞）共计29批次甘草进行质量评价，并进行聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘分析，对不同产地甘草的各项指标进行对比分析，以期为甘草相关产品开发过程中原料产地的选择提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

UltiMate 3000高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；Sepax Amethyst C18-H液相色谱柱（美国赛分有限公司）；Agilent 7890B气相色谱仪（美国安捷伦有限公司）；ICAP RQ电感耦合等离子体质谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；XS-105DU电子分析天平（梅特勒托利多科技有限公司）；PHOENIX马弗炉（美国CEM公司）；101-2AB电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；DFY-500C摇摆式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；药典三号筛（浙江上虞五四纱筛厂）。

甘草苷（批号111610-202209，95.2%，中国食品药品检定研究院）；甘草酸铵（批号110731-202122，94.4%，中国食品药品检定研究院）；铅镉砷汞铜混合对照溶液（610014-201701，中国食品药品检定研究院）；五氯硝基苯（批号：GSB05-1845-2016-2，1 000 μg/mL农业部环境保护科研监测所）；乙腈（色谱级，美国Fisher chemical公司）；磷酸（色谱级，批号C12326362，上海麦克林生化科技股份有限公司）；其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。29批不同产地甘草药材，由劲牌持正堂药业有限公司采集，经鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根，药材产地信息见表1。

表1 甘草样品产地信息

1.2 试验方法

1.2.1 水分测定

取约2 g通过2号筛的甘草粉末，根据《中国药典》通则水分测定法第二法测定，并计算供试品中的含水量（%）。

1.2.2 甘草苷、甘草酸含量测定

采用2020版《中国药典》甘草含量测定项下要求进行含量测定，所用色谱柱为Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，图1为对照品及甘草药材HPLC色谱图。

图1 甘草苷、甘草酸铵对照品及甘草HPLC色谱图

所有供试品甘草苷、甘草酸含量均以干燥品计。供试品含量=含量测定值×100/（100-水分测定值）。

1.2.3 总灰分、酸不溶性灰分、重金属及有害元素、其他有机氯类农药残留量、二氧化硫残留量测定

总灰分、酸不溶性灰分、重金属及有害元素、其他有机氯类农药（五氯硝基苯）残留量、二氧化硫残留量根据《中国药典》通则灰分测定法、酸不溶性灰分测定法、电感耦合等离子体质谱法、有机氯类农药残留量测定法、二氧化硫残留量测定法（酸碱滴定法）测定。

2 结果与分析

2.1 含量测定方法学确认

根据1.2.2小节条件开展甘草药材含量检测方法学确认，结果表明，甘草苷、甘草酸的中间精密度SRSD分别为1.5%和1.8%，重复性SRSD分别为2.4%和1.1%，表明仪器的精密度及方法的重复性较好，检测方法适宜性较好。

2.2 甘草样品测定结果

试验按照《中国药典》甘草项下要求对甘草苷、甘草酸、水分、总灰分、酸不溶性灰分、铅、镉、砷、汞、铜、五氯硝基苯、二氧化硫残留量进行了测定，29批甘草各指标均符合《中国药典》要求，其中五氯硝基苯、二氧化硫残留量在各批次药材中均未检出，其他各项测定数据如表2所示。水分主要与药材的干燥程度相关，此试验选取甘草苷、甘草酸、总灰分、酸不溶性灰分、铅、镉、砷、汞、铜共计9个指标进行分析，不同产地样品测定值箱状图如图2所示，各产地样本测定值之间存一定的差异，可采用化学计量学方法开展分析与评价。

图2 不同产地甘草样品检测情况箱状图

表2 29批甘草样品检测结果

2.3 聚类分析（CA）

以甘草苷、甘草酸、总灰分、酸不溶性灰分、铅、镉、砷、汞、铜测定结果作为变量，采用Origin-Pro 2023软件对以ward聚类方法结合Euclidean平方距离计算对29批甘草样品进行聚类分析，以ward聚类方法结合Pearson相关性对9个指标变量进行聚类分析，聚类分析结果见图3。结果表明，当判定距离为70时，甘草样本可被分为2类，其中甘肃兰州样品与新疆样本被聚为一类，甘肃省其他样本与内蒙古鄂尔多斯样本聚为一类；当判定距离为25时，甘草样本可被分为6类，甘肃兰州样本被聚为一类，新疆样本被聚为一类，甘肃白银样本被聚为一类，甘肃武威、金昌样本被聚为一类，内蒙古鄂尔多斯样本被聚为一类，甘肃酒泉样本被聚为一类。9个变量被聚为3类，甘草苷与甘草酸被聚为一类，汞与铜被聚为一类，总灰分、酸不溶性灰分、铅、镉、砷被聚为一类。从甘草聚类热图中可见，甘草原料的分类与各变量之间有一定相关性，可能与各种植地区的土壤、气候等因素有关。

图3 29批甘草样本聚类分析热图

2.4 主成分分析（PCA）

采用Origin Pro 2023软件对甘草苷、甘草酸、总灰分、酸不溶性灰分、铅、镉、砷、汞、铜测定结果进行主成分分析，计算相关矩阵的特征值、特征向量和分值。确定了特征值＞1的3个主成分，3个主成分的累计方差贡献率为66.62%，由相关矩阵的特征值所作碎石图见图4。第一主成分（PC1）解释了总方差的31.62%，信息主要来自于灰分、酸不溶性灰分、铅、镉和砷且均呈正相关；第二个主成分（PC2）解释了总方差的19.24%，信息主要来自于甘草苷和铜，并与甘草苷呈正相关，与铜呈负相关；第三个主成分（PC3）解释了总方差的15.76%，信息主要来自于甘草酸和汞，并与甘草酸呈正相关，与汞呈负相关。以PC1，PC2和PC3得分及特征向量绘制29批次甘草样本的双标图如图5所示，其中甘肃兰州样本（S1～S4）、甘肃白银样本（S5～S10）、新疆样本（S25～S29）分布相对独立；内蒙古鄂尔多斯与甘肃武威、金昌、酒泉样本较为相似且与甘肃白银样本相近，但也能得到有效区分；而各变量特征向量分布情况各异，与聚类分析中变量聚类情况相近。主成分分析与聚类分析结果相一致。

图4 主成分分析碎石图

图5 29批甘草样品主成分分析双标图

2.5 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

采用SIMCA14.1软件对29批甘草进行OPLS-DA分析，相关分析情况如图6和图7所示。结果表明，通过OPLS-DA可实现对组别1（兰州）、组别2（白银）、组别3（武威和金昌）、组别4（酒泉）、组别5（鄂尔多斯）、组别6（新疆）的有效区分，分析中的自变量拟合指数（R2X）为0.830，因变量拟合指数（R2Y）为0.719，模型预测指数（Q2）为0.550，R2和Q2均超过了0.5，表明该模型拟合结果可接受，同时通过200次置换检测，Q2回归线与纵轴的相交点小于0，说明模型不存在过拟合，所建立的模型有效，认为该结果可用于各产地甘草测定值的指标对比分析。所生成的变量VIP图如图8所示，并以VIP大于1为阈值，筛选出5个贡献值较大的成分，依次为砷、铜、总灰分、甘草苷和甘草酸，判断其为区分6个组别样本的代表性差异性成分。各项指标差异可能与甘草的土壤和种植环境等因素相关。

图6 OPLS-DA得分图

图7 OPLS-DA模型置换验证图

3 结论

试验对甘肃、内蒙古、新疆9个市/州共计29批甘草样本进行了采集，根据《中国药典》甘草项下要求进行了测定，所有样本均符合《中国药典》要求，因五氯硝基苯、二氧化硫均未检出，结合测定结果选取甘草苷、甘草酸、总灰分、酸不溶性灰分、铅、镉、砷、汞、铜9个指标作为变量进行化学计量学（CA、PCA及OPLS-DA）分析。聚类分析和主成分分析结果较为一致，样本可被分为甘肃兰州、新疆样本、甘肃白银样本、甘肃武威及金昌样本、内蒙古鄂尔多斯样本、甘肃酒泉样本6个组别，其中甘肃兰州样本与新疆样本较为相近，甘肃武威及金昌样本、内蒙古鄂尔多斯样本、甘肃酒泉3组样本较为相似且与甘肃白银样本相近；9个指标则可被分为3类，甘草苷与甘草酸分为一类，汞与铜分为一类，总灰分、酸不溶性灰分、铅、镉、砷分为一类。结合各批次甘草分类情况进行了正交偏最小二乘判别分析，可实现上述6个组别样本的有效区分，砷、铜、总灰分、甘草苷和甘草酸为区分6个组别样本的代表性差异性成分。试验结果可能与不同区域甘草的土壤、种植条件等因素有关。甘草在我国种植区域较广且为多基原药材，此试验采集的样本均为甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.药材，后期可进一步加大样本采集量，对3个不同基原的药材成分和品质进一步开展研究，以更加全面地了解甘草药材的品质情况。