不同酿酒原料发酵香气成分分析

刘芳，张清玫，王慧琳，易伟,4，彭志云,2,3，郑佳,2,3

1.宜宾五粮液股份有限公司（宜宾 644000）；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室（宜宾 644000）；3.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室（宜宾 644000）；4.沈阳农业大学食品学院（沈阳 110866）

中国传统浓香型白酒是以谷物为原材料，大曲为发酵剂，经固态发酵、蒸馏、储存、勾兑而成的蒸馏酒[1]。原料是浓香型白酒酿造的物质基础：一方面生产中采用混蒸混烧的工艺，将蒸馏过程原料挥发的香气物质带入酒体；另一方面在发酵过程中，原料又为微生物的生长代谢提供物质基础[2]。白酒酿酒原料品种众多，常见主要有高粱、玉米、小麦、糯米和大米，在酿酒界素有“高粱产酒香，玉米产酒甜，小麦产酒糙，糯米产酒绵，大米产酒净”之说，不同原料因营养物质含量不同，在发酵过程中产生的风味物质也各异。

对酿酒原料的研究主要集中于原料理化性质[3-5]及蒸煮过程中产生的游离态风味物质[6-9]。吕佳慧[2]研究结果表明，酿酒原料中丰富的结合态风味物质在发酵过程经由微生物及酶的作用，转化为游离态风味物质是原酒风味的重要组分，其含量约为原料中游离态风味物质的2～8倍，由此可见酿酒原料对白酒风味具有重要影响。江伟等[10]采用GC-O-MS技术对5种单一原料酿造白酒的风味物质进行定量分析，并结合感官感官评价分析，结果表明，5种单一粮食酿造白酒中，高粱酒香气成分及香气活性物质为单一粮食中最多，通过感官评价分析，结果发现高粱酒以酯香为主、整体协调，其风味在单一粮食中占优势地位，为单一粮食中最适合的酿酒原料。陆其刚等[11]选择5种常用酿酒原料，进行固液态发酵模拟试验与代谢产物分析，结果显示，单一酿酒原料发酵产生的风味物质各具特色，同一种粮食采用不同的发酵方式其代谢产物也存在较大差异；但单粮发酵存在一定局限性，产生的风味物质种类较单一。Han等[12]比较5种单粮酿造白酒的风味质量及风味物质含量，结果显示，高粱酒风味最佳，小麦酒次之；大米酒酯类物质含量低，醛类和醇类物质含量较高；进一步研究不同单宁含量的高粱酒，发现单宁含量与酯类物质含量密切相关。

为探究单粮及多粮发酵风味物质特性，以5种单一原料及其混合原料为研究对象，以糖化酶及酿酒酵母为糖化发酵剂，探究单粮及多粮在单一发酵剂的固态发酵体系中的风味物质特性，为酿酒原料的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱、大米、糯米、小麦、玉米、五粮粉（均来自生产车间）。

糖化酶（50 000 U/g，金源生物化工有限公司）；安琪酵母（安琪酵母股份有限公司）；同位素标品ethyl hexanoate-d11、acetic acid-d4、benzaldehyde-d6、2-phenylethyl acetate-d3、benzyl-d7 alcohol、phenol-2,4,6-d3（加拿大C/D/N公司）。

1.2 仪器与设备

刀式研磨仪（GM300，德国Retsch公司）；气质联用仪（7890B-5977B，美国Agilent公司）；DB-WAXETR色谱柱（30 m×0.250 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）；Lichrolut EN（200 mg/3 mL）萃取固相小柱（德国Merck公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

分别称取5种单粮各1 000 g，粉碎后过筛，选择粒径3～4 mm的用于后续试验；五粮粉为已粉碎的车间生产用粮。分别称取500 g粉碎后的原料，加350 mL热水（约65 ℃），搅拌均匀后堆积润粮1 h。原料采用清蒸，待蒸锅上汽后蒸粮35 min。蒸熟后加入350 mL开水，搅拌均匀后摊量至28 ℃。

1.3.2 接种培养

冷却后的粮食按以下方法进行处理：加入相当于原料干重0.2%的干酵母（使用前需经2%糖水活化活化30 min）及4 g糖化酶，搅拌均匀后装入1 000 mL密封发酵罐中，于35 ℃发酵30 d。

1.3.3 固相萃取

称取10 g样品，加入20 mL 10%乙醇水溶液，和50 μL 1 000 mg/kg混合同位素内标，涡旋3 min，按10 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm微孔滤膜。取10 mL上述滤液上0.5 g Lichrolut EN小柱，用6 mL二氯甲烷洗脱，加入2 g无水硫酸钠去除残余水分，将液体转入干净的瓶中氮吹至500 μL上机。

1.3.4 GC-MS条件

1.3.4.1 GC条件

载气为高纯度氦气，流速1 mL/min，不分流，进样口温度250 ℃。升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。

1.3.4.2 MS条件

全扫描模式；EI离子源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描范围30～350 amu。

1.3.5 定性和定量

1.3.5.1 风味物质性方法

发酵粮食香气成分定性通过与NIST 14质谱中标准谱图对比匹配，保留指数根据Kovats法[13]计算后与文献进行比对后确认。

1.3.5.2 风味物质定量方法

定量采用内标法测定，参考内标质量浓度，以待测成分与内标的峰面积之比计算待测成分的半定量信息，单位以mg/kg表示。

2 结果与分析

2.1 酿酒原料发酵风味物质分析

对发酵后酿酒原料进行定量分析，风味物质主要包括酯类（16种）、酸类（7种）、酚类（6种）、芳香族（5种）、呋喃类（5种）、醇类（5种）、其他类（8种），酿酒原料风味物质组成见图1。高粱、大米、糯米、小麦、玉米及混合五粮发酵后鉴定到风味物质分别为52，50，45，51，51和51种，表1展示各香气成分含量。

图1 酿酒原料发酵香气成分含量

酯类物质为白酒中重要的呈香物质，5种单粮及混合五粮中，小麦及五粮酯类物质总含量最高。琥珀酸单乙酯为含量最高的酯类物质，在五粮及小麦中含量较高、高粱及大米次之、糯米中含量最低。四大酯中乳酸乙酯含量最高，在5种单粮及混合五粮中其含量具有显著差异：五粮及小麦中最高，大米次之，高粱及玉米中相对较低，糯米中含量极低。乙酸乙酯含量主要表现为五粮较高，其余粮食含量较相近。酯类物质总含量及四大酯含量均表现为五粮＞小麦＞大米＞高粱＞玉米＞糯米。

芳香族物质是白酒中重要的风味物质，具有香味突出、阈值低的特点。白酒中芳香族物质主要来源于微生物发酵代谢原料中的单宁、蛋白质等[14]。发酵粮食中芳香族物质总含量最高，约为总物质含量的70%～90%，其含量在高粱和玉米中尤为突出。含量最高的芳香族化合物分别为苯甲醇、苯乙醇及苯甲醛。苯乙醇具有玫瑰花香气，在高粱含量最高、玉米次之，糯米中最少。苯甲醇具有花果香味，在玉米中含量最高；苯甲醛具有杏仁香、坚果香，其含量在蒸煮粮食中较高[15-16]，在5种单粮及混合五粮中含量无明显差异。

醇类物质在白酒中具有烘托香味的作用，同时还是合成酯类物质的前驱物质，其主要来源于酵母菌代谢糖类和氨基酸[17]。发酵粮食中检出的5种醇类物质，均为高级醇，现有研究表明，过量的高级醇不仅使白酒呈苦涩味影响口感[18]，对人体也有一定毒害作用，高级醇较乙醇化学结构更复杂，在人体内代谢也更缓慢，过量累积会对人体神经系统产生麻醉和毒害并导致肝损伤[19-20]。发酵粮食中高粱与玉米异丁醇及异戊醇含量相对较高，其中作为单粮酿造白酒常用原料的高粱，异戊醇及异丁醇含量约为五粮的4倍。

酸类物质为白酒中重要的香气成分，其酸味随碳链的增加而减弱，在发酵单粮及混合五粮中含量均较低。己酸是含量最高酸类物质，具有典型的汗臭味，是浓香型白酒主体香味己酸乙酯的前体物质。糯米己酸含量尤为突出，其余粮食无明显差异。异戊酸与异丁酸含量仅次于己酸，其含量表现为玉米含量最高、高粱大米次之，五粮与糯米含量最低；丁酸、苯丙二酸、戊酸及丙酸含量较低，其中小麦丁酸及丙酸含量相对较高、玉米中苯丙二酸相对含量较高，大米中戊酸含量相对较高。纵向比较发酵粮食，高粱及五粮酸类物质相对含量较均衡，无含量突出的酸。

白酒中的酚类物质主要来源于酿酒原料中单宁、木质素的降解[21]。酚类物质能够赋予白酒特殊的香气：愈创木酚具有水果香、花香，4-乙烯基愈创木酚具有水果香、香瓜味，香草醛具有奶油香、甜香味，苯酚具有墨汁香气[22]。在5种单粮及混合五粮中，高粱与玉米酚类物质总量最高，苯酚为发酵粮食中含量最高的酚类物质，在高粱中含量最高，五粮次之。发酵粮食中玉米愈创木酚含量最高、高粱次之；4-乙烯基愈创木酚在发酵粮食中含量表现为糯米＞大米＞小麦＞玉米，在五粮中未检出。玉米中香草醛含量最高，小麦次之、大米及糯米中含量最低。

呋喃类物质主要表现为焦香、坚果香、烤杏仁香味[23]。发酵粮食中的呋喃类化合物主要为糠醛及2,3-二羟基苯并呋喃。小麦中糠醛含量较高、其余粮食中含量极低。2,3-二羟基苯并呋喃为玉米中特有的呋喃类物质，在其余发酵粮食中含量极低。

发酵粮食中共检出其他类化合物8种，2-甲基四氢噻吩及3-甲硫基丙醇为硫化物。硫化物是一类含量十分少、阈值极低的化合物，该类化合物大多具有卷心菜、腐败的大白菜、腐败的韭菜、生洋葱或炒熟的洋葱的气味[24]。2-甲基四氢噻吩在较低浓度时具有烘焙香气，其在玉米及高粱中含量较高，其余发酵粮食中含量较低且无明显差异；3-甲硫基丙醇低浓度下具有咖啡香味，其在玉米中含量最高。内酯具有椰香味[25]，阈值低，是白酒中重要的风味物质，发酵粮食中检出2种内酯，分别为泛酰内酯及丁内酯。泛酰内酯在小麦中含量最高，丁内酯在玉米中含量最高。乙偶姻为白酒中关键化合物四甲基吡嗪的前体物质，主要来源于酿酒原料蒸煮过程中发生的美拉德反应，其含量在糯米中最高，在高粱中最低。

2.2 酿酒原料关键香气成分相关性分析

为更直观描述发酵粮食中风味物质的相关性，使用Rcorrplot包计算Pearson相关系数并绘图，样本间相关性系数由-1～1表示，值约接近1则表明其相关性越强。由图2可知，高粱与玉米相似度最高，相关系数0.91，结合表1各类风味物质含量可知，高粱与玉米发酵体系中芳香族、醇类及呋喃类物质含量较高，酯类化合物含量较低；小麦与五粮相关性较强，相关系数为0.86，小麦与五粮芳香族化合总量相近、酯类化合物含量较高，醇类物质含量相对较低；糯米因其风味物质总量低与其他几种酿酒原料差异相对较大。

图2 发酵粮食相关性

3 结论与讨论

以高粱、大米、糯米、小麦、玉米，及混合五粮为原料，糖化酶、酿酒酵母为发酵剂进行模拟固态发酵试验，结果表明，不同原料发酵产生的风味物质存在明显差异，且与传统关于酿酒原料特性一致。基于香气成分含量对发酵粮食的分析结果表明，高粱因其原料特性，发酵产生的芳香族物质、酚类物质含量相对较高，因此有“高粱产酒香的”说法，大米发酵产生的香气成分含量较低但较均衡，与“大米产酒净”相符。糯米发酵产生的香气成分种类及含量均为5种单粮中最低，芳香族化合物含量相对其他组分较高，符合“糯米产酒绵”的说法。小麦风味物质组成与五粮最为相似，具有酯类物质含量高的特点。玉米发酵产生的醇类物质含量较高，物质间缺乏协调感，该结果与江伟等[10]的研究结果一致。混合五粮发酵产生的香气成分含量较均衡，且酯类物质含量最高，而浓香型白酒主要以己酸乙酯为主体香，采用五粮作为浓香型白酒酿酒原料能更好的突出其香型特点。与单粮发酵相比，五粮发酵产生的高级醇含量最低，酯类物质更多，香气成分含量较均衡，为最适宜的酿酒原料。