HPLC-MS/MS法测定猪肉中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇

双杨，赵燕，夏林林，吴磊磊，陈银华

1.十堰市食品药品检验检测所（十堰 442000）；2.十堰市黄龙镇中心小学（十堰 442000）

瘦肉精根据其结构差异主要分为克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特罗和盐酸多巴胺7种[1]。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇属于β-肾上腺素受体激动剂类药物，该类药物能够促进动物体内的营养物质重新分配，增加肌肉蛋白沉积，从而显著提高动物酮体的瘦肉率[2]。因此，该类药物被大量非法用于畜牧生产，这也导致食用其饲料的动物组织和肌肉中都会存在不同程度残留。

人类长期食用含有β-肾上腺素受体激动剂类残留的动物源性食品会对人体健康造成极大的损害，可能会引起急性中毒，患者出现肌肉震颤、心悸、头部和肌肉疼痛等症状[3-4]。我国明令禁止使用克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的使用，但在许多地方仍在非法使用，同时一些肉制品加工企业由于缺乏质量控制意识，原料把关不严，使用存在残留的动物源食品加工，导致市场上一些加工肉制品也含有药物残留。

β-肾上腺素受体激动剂类残留的检测方法主要有气相色谱-串联质谱法[5-6]、高效液相色谱-串联质谱法[7]、酶联免疫法[8-9]、电化学法[10]和高效液相色谱法[11]等，各种方法均有其相应的实用性。主要参照GB 31658.22—2022《动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》探索高效液相色谱-串联质谱法检测猪肉中β-肾上腺素受体激动剂克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的方法学验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AB Sciex QTRAP 4500液相色谱质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；LYZD-822水浴恒温摇床（常州金坛良友仪器有限公司）；WH966涡旋混合器（上海康华生化仪器制造有限公司）；高速组织捣碎机（江苏金坛）；80-1型高速离心机（上海手术器械厂）；B30002电子天平（德国赛多利斯）。

甲醇、乙酸铵、乙酸乙酯、甲酸、叔丁基甲醚（均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；高氯酸（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；氨水（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；β-葡萄糖醛酶/芳基硫酸酯酶（默克中国）；水为GB/T 6682—2008 《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水（自制）；混合阳离子交换固相萃取柱（60 mg/3 mL，上海安谱实验科技股份有限公司）；克伦特罗-D9内标储备液（浓度100 μg/mL，tmstandard公司）；莱克多巴胺-D6内标储备液（浓度100 μg/mL，tmstandard公司）；沙丁胺醇-D3内标储备液（浓度100 μg/mL，tmstandard公司）；克伦特罗标准储备液（浓度100 μg/mL，坛墨质检科技股份有限公司）；莱克多巴胺标准储备液（浓度100 μg/mL，坛墨质检科技股份有限公司）；沙丁胺醇标准储备液（浓度100 μg/mL，坛墨质检科技股份有限公司）。

1.2 标准系列溶液的配制

混合内标工作溶液：精密量取克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3标准溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成500 ng/mL混合内标工作溶液。

混合标准工作溶液：精密量取克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成500 ng/mL混合标准工作溶液。

按表1精密量取混合标准工作溶液和混合内标工作溶液，分别用甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）定容至25 mL，制成质量浓度分别为1，2，5，10，20和50 ng/mL，内标质量浓度5 ng/mL的标准系列溶液。

表1 标准系列溶液的配制

1.3 样品溶液的配制

1.3.1 酶解与提取

准确称取2 g左右样品于50 mL聚丙烯离心管中，加6 mL 0.2 mol/L乙酸铵缓冲溶液、40 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀，于37 ℃避光水浴振荡16 h，放置至室温，备用。

1.3.2 萃取、净化与浓缩

取备用液，加100 μL 100 ng/mL内标工作液，涡旋混匀，按8 000 r/min离心8 min，取上清液，加5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，涡旋混匀，用高氯酸调至pH 1.0，按8 000 r/min离心8 min后，将上清液用10 mol/L NaOH溶液调至pH 10.0。加15 mL乙酸乙酯，中速振荡5 min，按5 000 r/min离心5 min，取上层有机相。下层水相中加入10 mL叔丁基甲醚，中速振荡5 min，按5 000 r/min离心5 min，取上层有机相，合并，在50 ℃下氮气吹干，用5 mL 2%甲酸溶液溶解，备用。

取混合型阳离子交换固相萃取柱，依次用甲醇、2%甲酸溶液各3 mL，活化，取备用液过柱，依次用2%甲酸溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脱，洗脱液在50 ℃下氮气吹干。残留物中加入0.5 mL甲醇-0.1甲酸溶液（10+90，V/V），充分溶解，过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱Kinetex®2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm，美国飞诺美）；流速0.4 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序见表2。

表2 克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的梯度洗脱条件

1.4.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描；监测模式为多反应监测（MRM）；气帘气压力35 psi；喷撞气压力9 psi；离子化电压5500 V；温度550℃；喷雾气压力55 psi；辅助加热气压力55 psi。

1.5 定性与定量测定方法

在同样的测试条件下，试样溶液的保留时间与标准溶液保留时间的偏差应在±2.5%之内；试样溶液中的离子相对丰度比与标准溶液中的离子丰度相比，应符合表3的要求。

表3 试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围

定量采用内标法，克伦特罗以克伦特罗-D9为内标物，莱克多巴胺以莱克多巴胺-D6为内标物，沙丁胺醇以沙丁胺醇-D3为内标物。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

分别取300 ng/mL的克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3标准溶液，通过针泵注入质谱系统进行参数优化。在正离子模式下进行全扫描，扫描范围为质荷比（m/z）200～400，根据质谱图选择响应最高的离子作为母离子。不断增加CE值，改变碰撞能使母离子破碎，选择响应值较强的2个离子作为定量离子和定性离子，在多反应监测（MRM）模式下，优化碰撞能（CE）及去簇电压（DP）。优化后的克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的质谱参数见表4。

表4 克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的质谱参数

2.2 色谱柱的优化

选择高效的色谱柱是检测克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的基础，分别选择色谱柱Kinetex®2.6 μm F5 100A（100 mm×2.1 mm）、Kinetex®2.6 μm Phenyl-Hexyl 100A（100 mm×2.1 mm）及Kinetex®2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）的3种色谱柱进行试验，检测它们对3种化合物的分离效果。结果表明，色谱柱型号Kinetex®2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）的效果最好，总离子流图，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇及内标特征离子色谱图如图1～图4所示。因此，选择Kinetex®2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）色谱柱进行试验。

图1 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇质量浓度50 ng/mL时的总离子流图

图2 克伦特罗及内标特征离子色谱图

图3 莱克多巴胺及内标特征离子色谱图

图4 沙丁胺醇及内标特征离子色谱图

2.3 方法线性范围的验证

将配制好的标准系列溶液按照浓度由低到高的顺序进样测定。以待测药物定量离子峰面积和对应内标定量离子峰面积比为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准曲线图谱如图5所示，线性范围、线性方程及相关系数见表5。

图5 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准曲线

表5 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的线性范围、线性方程及相关系数

由图5和表5可知，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇在1.0～50.0 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，3种化合物线性回归方程的相关系数均大于0.999，满足方法线性要求。

2.4 检出限和定量限的验证

2.4.1 检出限

按GB 31658.22—2022《食品安全国家标准 动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》中取样量2.00 g，定容体积0.5 mL，检出限要求0.2 μg/kg计算，此时克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的浓度为0.8 ng/mL，用适量混合标准工作溶液配制浓度0.8 ng/mL的溶液进行测定，测定其信噪比。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检出限相关检验数据见表6。

表6 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检出限检验数据

2.4.2 定量限

按GB 31658.22—2022《食品安全国家标准 动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》中取样量2.00 g，定容体积0.5 mL，定量限要求0.5 μg/kg计算，此时克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇质量浓度为2.0 ng/mL，用质量浓度2.0 ng/mL混合标准工作溶液进行测定，测得其信噪比。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇定量限具体检验数据见表7。

表7 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇定量限检验数据

由表6好表7可知，当使用克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的方法检出限0.2 μg/kg验证时，3种化合物测定的性噪比均大于3，满足方法检出限的要求；当使用克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的方法定量限0.5 μg/kg验证时，3种化合物测定的性噪比均大于10，满足方法定量限的要求。

2.5 回收率的验证

向阴性样品中添加克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准品，添加质量分数水平分别为1.0，4.0和8.0 μg/kg，按GB 31658.22—2022《食品安全国家标准 动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》进行处理检测。克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇3种化合物加标回收试验结果见表8。

表8 阴性样品中添加克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的回收率

3种化合物克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的回收率在81.0%～94.0%，满足方法回收率要求。

2.6 精密度的验证

取添加浓度水平4.0 μg/kg克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准品的阴性样品，按GB 31658.22—2022《食品安全国家标准 动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》进行处理并重复测定7次。克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇3种化合物测定的相对标准偏差试验结果见表9。

表9 阴性样品中添加克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的精密度（n=7）

重复测定加标样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的相对标准偏差分别为1.83%，3.07%和3.50%，满足方法精密度要求。

3 结论

通过采用高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中的克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇，并从线性、检出限、定量限、回收率、精密度等方面对方法进行验证。试验结果表明：在线性方面，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇在1.0～50.0 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，3种化合物线性回归方程的相关系数均大于0.999；在检出限及定量限验证方面，当方法检出限为0.2 μg/kg时，3种化合物测定响应值均大于3，方法定量限为0.5 μg/kg时，3种化合物测定响应值均大于10；在回收率方面，3种化合物克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的回收率在81.0%～94.0%；在精密度方面，重复测定的样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的相对标准偏差分别为1.83%，3.07%和3.50%。因此，上述几个方面均满足方法验证要求。