UPLC-MS/MS法测定食用植物油中乙基麦芽酚的基质效应
2024-04-13傅群刘凤鸣何毓文余建兵
傅群，刘凤鸣，何毓文，余建兵
吉安市食品药品检验检测中心（吉安 343000）
乙基麦芽酚是一种广泛使用的食品用合成香料，但近年来有不法商贩将其加入食用植物油中以掩盖原有的不良气味而达到以次充好或造假的目的。长期食含有乙基麦芽酚的食品可能出现头疼、恶心、呕吐等副作用，并可能导致骨骼和关节相关的某些疾病[1-3]。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[4]中明确规定植物油脂中不得添加任何香精香料。
检测机构依据市场监督管理总局发布的补充方法BJS 201708《食用植物油中乙基麦芽酚的测定》[5]开展检测工作。该方法采用空白基质配制标准曲线，但食用植物油种类繁多，加工方法不尽相同，要想获得与每个样品匹配的空白基质较为困难。此外，该方法对样品无净化步骤，对仪器的污染也较大。
样品中除分析物以外的组分对分析过程的干扰和分析结果准确性的影响被称为基质效应（matrix effect，ME）[4]。在质谱分析过程中，ME会不同程度地影响方法的准确度[7-8]，因此对ME进行评估已成为其方法学评价的一个基本部分[9-10]。
多项研究建议弱基质效应的分析物，在不影响分析准确度的前提下，其基质效应可忽略[11-13]。近年来，对乙基麦芽酚的研究更多集中在对不同样品基质中检测方法的开发上[14-16]，对基质效应进行全面系统的评价鲜有报道。
鉴于检验机构的实际状况，依据BJS 201708《食用植物油中乙基麦芽酚的测定》，以菜籽油、芝麻油、玉米油等多类食用植物油为研究对象，采用提取后基质匹配添加法，对其基质效应开展全面系统评价，评估空白基质配制标准曲线的必要性并探索补偿措施，以期在保证分析结果准确度的前提下，减少精密仪器的损耗，切实提高检测效率。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Waters BEH C18色谱柱（200 mm×2.1 mm，1.7 μm），Waters VeroTQS超高效液相色谱质谱联用仪（沃特斯中国有限公司）；TGL-18M高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；Quintix224-1CN电子天平（德国赛多利斯公司）；SDC-3000多管涡旋混匀仪（深圳逗点生物技术有限公司）。
乙基麦芽酚标准溶液（质量浓度1 000 mg/L，坛墨质检-标准物质中心）；甲醇（质谱纯，上海安谱科技实验股份有限公司）；甲酸（色谱纯，美国SPS公司）；试验用水符合实验室一级用水。
所用菜籽油、芝麻油、玉米油，油茶籽油、大豆油、葵花籽油、花生油、食用植物调和油、米糠油、橄榄油和核桃油均为市场购买或生产企业现场采样获得。
1.2 液相色谱-串联质谱条件
1.2.1 液相色谱条件
色谱柱采用BEH C18色谱柱（200 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温35 ℃；流速0.4 mL/min；进样量2 μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
1.2.2 质谱条件
离子源为电喷雾正离子源式（electrospray ionization，ESI+）；数据方式采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；毛细管电压2 800 V；锥孔电压35 V；离子源温度150 ℃；干燥气温度500 ℃；干燥气流速1 000 L/h（氮气）；锥孔气流速150 L/h（氮气）；碰撞气为氩气；其他质谱检测参数见表2。
表2 乙基麦芽酚的质谱参数
1.3 溶剂匹配标准溶液配制
准确移取0.50 mL乙基麦芽酚标准溶液（质量浓度1 000 mg/L），用甲醇定容至100 mL，制备成5 mg/L的标准中间液，于-18 ℃储存。将标准储备液分别用甲醇稀释至质量浓度为2.5，5.0，25.0，50.0，200.0和500.0 μg/L的溶剂匹配标准系列工作液，置4 ℃冰箱内避光保存，待测。
1.4 空白基质溶液制备
准确称取10 g（精确至0.01 g）样品置于50 mL聚丙烯离心管中，用移液器准确加入10 mL甲醇，在2 500 r/min条件下涡旋振摇2 min，在4 ℃条件下按9 000 r/min离心10 min，将上清液移入20 mL具塞刻度试管中，下层油液用10 mL甲醇重复提取1次，合并上清液，用甲醇定容至20 mL，经微孔滤膜（0.22 μm，有机相）过滤，供液相色谱-串联质谱分析。
1.5 基质标准工作溶液配制
将标准储备溶液分别用不同的空白基质溶液稀释至质量浓度为2.5，5.0，25.0，50.0，200.0和500.0 μg/L的系列基质匹配标准工作液。
2 结果与分析
2.1 线性范围和检出限、定量限
采用甲醇配制标准曲线，在选定的色谱条件和质谱条件下测定，以目标物质量浓度（μg/L）为横坐标，以目标物峰面积为纵坐标，建立线性关系。相关系数（R2）为0.999 3，线性关系良好。以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表3。总离子流图（TIC）和特征离子质谱图见图1。
图1 乙基麦芽酚的总离子流图（TIC）和特征离子质谱图
表3 乙基麦芽酚的线性范围、线性回归方程、相关系数、方法检出限和定量限
2.2 精密度和回收率
在空白基质样品中分别加入低、中、高3个不同浓度的标准溶液。结果见表4。乙基麦芽酚的平均加标回收率为82.7%～95.1%，相对标准偏差为1.98%～7.93%，结果表明该方法具有可靠的准确度和精密度。
表4 乙基麦芽酚的平均回收率和相对标准偏差（n=6）
2.3 基质效应评价方法
评价不同食用植物油的基质效应强弱，以曲线斜率计算基质效应（ME）[17-18]，见式（1）。
式中：k1为基质匹配曲线斜率；k2为溶剂曲线斜率。
若ME=100%，说明无基质效应；若ME＜0，呈基质抑制效应；若ME＞0，呈基质增强效应。当|ME|＜20%时为弱基质效应；20%≤|ME|≤50%为中等基质效应；|ME|＞50%时为强基质效应[17-19]。
2.4 食用植物油基质效应评价
选取11种常见的食用植物油，共42个样品，样品的具体信息和基质效应见表5。42个样品全部呈现基质抑制效应，|ME|在1.8%～39.2%。14号芝麻油的|ME|最强，为39.2%；37号橄榄油的|ME|最弱，为1.8%。其中34个样品表现为弱基质效应，其色泽主要为淡黄色、浅黄色和黄色。而其余8个样品都为中等的基质效应，其色泽为橙黄色、棕色以及棕褐色。淡黄色和浅黄色样品的|ME|≤6.1%，如一级菜籽油、一级油茶籽油、一级大豆油、橄榄油和核桃油；黄色样品的|ME|有所增加，但也都在16.8%以下。随着样品色泽的加深（从橙黄色、棕色至棕褐色），|ME|也从19.5%逐步增大至39.2%。这种趋势在同种食用植物油中也很明显。如1～9号菜籽油，随着级别降低，样品的色泽加深，其|ME|从2.5%增大至33.8%。芝麻油以及其他的油类也是如此。
表5 42个样品的信息和基质效应
菜籽油和芝麻油由于其自身的产品特点以及民间的土榨工艺较为简单，所以整体上菜籽油和芝麻油呈色较深的占有会比其他品种的食用植物油更高，尤其是芝麻油。而大豆油、玉米油、调和油和橄榄油等大部分都呈色较浅，这些油类的基质效应也相对弱。食用植物油色泽的深浅也在一定程度上反映其杂质含量的大小[20-22]。因此推论随着食用植物油杂质含量的增大，色泽加深，其基质效应也显著增强。
2.5 基质效应的补偿
强基质效应对质谱分析方法的准确度具有较大的影响，普遍认为：当|ME|≤20%时可忽略；若|ME|≥20%，则应采取措施进行补偿[23]。通常的补偿方法有同位素内标法[24]、优化前处理方法[15,25]、优化色谱分离条件[26]和采用空白基质匹配标准曲线等[27]。
葛敏敏等[15]建立一种全新的前处理方法，有效减少芝麻油的基质效应，但该方法步骤较为繁琐。刘川等[24]采用同位素内标法以减少基质效应，而同位素内标物获得较为困难，价格昂贵。因此，兼顾效率和经济，采用样品稀释法开展补偿研究。
定义稀释因子d=样品基质稀释后体积/样品基质最初体积。为确保方法的检出限不高于BJS 201708中的25.0 μg/kg，分别考察稀释因子为2和5时的基质效应。对比7，8，9，12，13，14，30和36号的样品基质未稀释和稀释因子为2和5时的基质效应，结果见图2。
图2 不同的稀释因子对基质效应的影响（n=3）
从图1可以看出，随着稀释因子的增大，基质效应明显减弱，稀释因子为5时，8个样品的|ME|均在10%以下，呈现出较弱的基质效应。试验中标准曲线的范围为2.5～500 μg/L，稀释因子为5时，方法的检出限为25.0 μg/kg。因此在满足灵敏度要求的前提下，对样品进行适当稀释有助于减小基质效应，并能减小至可忽略的程度。
3 结论
以BJS 201708为依据，考察乙基麦芽酚在菜籽油、芝麻油、玉米油，油茶籽油、大豆油、葵花籽油、花生油、食用植物调和油、米糠油、橄榄油和核桃油11种共42个样品中的基质效应，其中34个样品为弱基质效应，其余8个样品为中等基质效应。基质效应与食用油的种类无明显关系，而是随着样品色泽的加深而表现出增加的趋势。对8个具有中等基质效应的样品进行稀释，稀释因子为5时，样品的基质效应均减小至可被忽略（|ME|最高为9.9%）。
因此建议在日常检测工作中，对呈色较浅（浅黄色至黄色）的样品可直接用溶剂配制工作曲线（2.5～500 μg/L）进行定量，而对呈色较深（橙黄色至棕褐色）的样品可进行适用的稀释后采用溶剂配制工作曲线进行定量，提高检测效率的同时减少对精密仪器的损耗。同时，试验结果可为乙基麦芽酚国标方法的建立提供相应的数据参考。
