韭菜中杀菌剂类农药残留检测技术研究进展

闫艳华，谷守国，刘会会，周彦成，王磊，汤思凝

1.唐山市食品药品综合检验检测中心（唐山 063000）；2.农业农村部农产品品质评价与营养健康重点实验室（唐山 063000）；3.河北省农产品质量安全检测技术创新中心（唐山 063000）；4.唐山市功能性农产品产业技术研究院（唐山 063000）

韭菜是百合科葱属多年生宿根植物，是我国特有的蔬菜品种[1]。据农业农村部统计数据和国家特色蔬菜产业技术体系调研汇总，韭菜在我国种植面积常年约40万 hm2（600万亩），是所有蔬菜中分布最广的种类[2]。其营养丰富且有一定的药用价值，富含维生素、纤维素、碳水化合物等，利于润肠通便、行气理血，深受消费者喜爱[3]。在韭菜的生产、流通、贮藏过程中，常见病害有灰霉病、疫病、枯萎病、锈病、白粉病、黄叶病、干尖、白绢病、茎枯病、软腐病等真菌病害，会严重降低产量和质量，常使用有机杀菌剂，即通过使用化学物质来抑制或杀灭细菌、真菌等微生物来保证其产量和品质[4]。有机杀菌剂活性范围广、作用位点多，是减少韭菜腐烂、病害的有效手段，也是流通贮藏期间广泛使用的保鲜措施[5]。杀菌剂在保护韭菜生长、提高产量和保障储存质量等方面发挥至关重要的作用，但杀菌剂残留不可避免地会对韭菜造成污染，从而对动物体及人体健康产生不良影响。近年来，我国食品安全抽检结果社会公示中频繁曝光韭菜中以杀菌剂腐霉利超标为主的农药污染问题[6-7]，造成消费者产生“毒韭菜”的认识。

杀菌剂类农药残留问题社会关注度高[8]，各个国家和地区分别发布并执行的涉及农药安全和限量标准有千余项。我国亦有一系列的法律法规的实施增强农药的监管力度，如《中华人民共和国食品安全法》《中华人民共和国农产品质量安全法》《中华人民共和国农药管理条例》等。现行国家标准GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》对近160种杀菌剂的最大残留限量（MRL）进行规定[9]。

1 韭菜中常用杀菌剂概况

杀菌剂通常是指能够有效防治和杀死病原微生物的化学药剂，按作用方式不同可分为内吸性杀菌剂和保护性杀菌剂等。杀菌剂类型见表1。内吸性杀菌剂能被植物叶、茎、根、种子吸收进入植物体内，具有治疗和保护作用，如多菌灵、甲霜灵等；保护性杀菌剂不能被植物内吸并传导、存留，不能用来防治深入植物体内的病害，只具有保护作用，如代森锰锌、福美双、百菌清等[10]。韭菜中常用的杀菌剂按防治病害种类分类主要有腐霉利、嘧霉胺、烯酰吗啉、异菌脲等，见表2。

表1 杀菌剂类型

表2 韭菜中常用杀菌剂

2 韭菜中常用杀菌剂前处理技术

韭菜的基质十分复杂，对于韭菜的杀菌剂农药残留检测而言，样品的前处理技术尤其关键，传统的样品前处理技术不易实现基质成分的有效净化，对农药检测容易产生基质效应，对分析仪器的灵敏度造成很大影响，进而影响测定结果的准确性和重现性[11]。现阶段，前处理技术在朝着省时省力、高效、试剂消耗少、环境影响小等方面发展。常用的前处理方法有固相萃取、固相微萃取、分散固相萃取、液液萃取、凝胶渗透色谱及QuEChERS法等[12]。

2.1 固相萃取技术

固相萃取技术（solid phase extraction，SPE）是近些年发展的前处理技术，其原理是利用液相色谱法的分离原理。先使用固体吸附剂选择性吸附农药成分，除去样品基质和干扰化合物，再使用洗脱剂将农药洗脱下来的方法[13]。该技术减少样品预处理过程，操作简单、回收率高、重现性好，可与其他仪器联用实现自动化，越来越广泛地应用于杀菌剂类农残检测中，但固相萃取柱大多是一次性的，虽然净化效果好，但样品用量较大时成本较高，浓缩过程耗时久[14]。

张群等[15]将韭菜样品的乙腈提取物经石墨化炭黑/氨基混合型固相萃取柱净化、洗脱及浓缩定容后进行检测，氯氟氰菊酯的回收率在81.7%～99.1%之间，相对标准差在2.5%～8.7%之间，该方法的检出限为0.001 mg/kg，定量限为0.01 mg/kg，能满足韭菜中氯氟氰菊酯残留检测的要求。Xia等[16]应用Oasis MCX固相萃取柱进行样品的提取和净化，结合超高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测样品中的13种杀菌剂，回收率为80%～101%，检测限为0.1～1.0 g/L。徐秋生等[17]选用乙腈均质法提取，固相萃取柱净化对蔬菜样品进行处理，敌菌灵和苯甲酰脲类杀菌剂残留的平均回收率在83.5%～105.6%之间，适用于蔬菜中上述2类杀菌剂农药残留的检测。周瑶等[18]采用氨基固相萃取柱前处理净化技术，建立超高效液相色谱-串联质谱法同时测定6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的方法，该方法操作简单，能满足果蔬中6种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的检测要求，重复性好。

2.2 固相微萃取技术

固相微萃取技术（solid phase microextraction，SPME）是20世纪90年代初期在固相萃取技术基础上发展起来的集萃取、浓缩和进样于一体的新型样品前处理技术。根据萃取方式以及萃取装置不同分为多种萃取方法，可与多种检测技术联用，具有操作简单、省时安全、灵敏度高、选择性好、无需溶剂等显著优点。SPME依靠萃取纤维取代填料实现目标物的分离，萃取纤维可以重复利用，不再是一次性消耗品。但由于SPME需要使用特殊装置，仅可针对少数部分农药残留使用，而且虽然材料可以重复利用，但所需装置价格比较昂贵，成本依然较高，导致目前在农残检测分析上并没有SPE使用普遍[19]。刘苗等[20]使用固相微萃取技术进行前处理后，测出蔬菜中有机磷类和拟除虫菊酯类共23种农药残留。Munitz等[21]采用固相微萃取前处理方法，研究嘧菌酯和唑菌胺酯在蓝莓中的残留检测，该方法选择性好、准确度和灵敏度高。崔宗岩等[22]用优化后的固相微萃取方法对161种农药残留进行检测，将固相微萃取装置加入内标样品的顶空瓶，加入SPME纤维并伸出萃取头，对萃取纤维进行检测，平均回收率为60.0%～110.0%，该方法的重复性较好，说明固相微萃取方法具有较好的处理效果。

2.3 液-液萃取技术

液-液萃取（liquid liquid extraction，LLE）是早期农产品传统的前处理技术，常被用于杀菌剂残留的检测，主要利用各农药在不同溶剂中溶解度的不同进行提取，具有简便、提取效率比较高的优势。该方法操作过程使用的提取溶剂包含乙酸乙酯、二氯甲烷、甲酸、甲醇、乙腈、丙酮等。全国多数检测机构目前仍旧选用食品安全国家标准NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》中有机磷类和有机氯类农药残留的检测前处理方法，采用乙腈提取韭菜中的农药及其代谢物以确证韭菜中杀菌剂等农药残留[23]。该处理方法萃取效率较高，处理时间较短，但前处理方法的净化方式稍有不足，特别是提取液的盐分含量过高、色素残留多、基质复杂等缺点易影响仪器的检测。液-液萃取如果有针对性地配合其他条件或技术可以更好完成农残提取净化。有研究利用低温富集液液萃取结合气相色谱-串联质谱法检测样品中15种农药残留，结果也达到相关标准要求[24]，充分证明液-液萃取搭配低温等条件时可以更有效满足农产品农药残留检测要求。

2.4 凝胶渗透色谱技术

凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）分离是一种物理过程，普遍用于有机污染物的分析上，能够很好分离有机大分子物质，技术使用范围广、重现性好、柱子重复利用和自动化程度高。但对于基质比较复杂的样本，凝胶渗透色谱对分子大小相近的杂质难以去除；采用大内径GPC柱检测时需要大量有机溶剂，操作难度大。凝胶渗透色谱在韭菜类色素含量高的样品具有良好的净化效果，有效降低基质干扰，提高杀菌剂类农药残留前处理效率。

刘国平等[25]将韭菜样品经过乙腈均质提取，经凝胶渗透色谱法净化后，进样口选用超高惰性衬管，能显著降低甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、水胺硫磷等强极性农药的基质效应。封利会等[26]使用凝胶渗透色谱结合气相色谱质谱仪检测蔬果中41种农药残留，样品用乙腈-乙酸钠缓冲液提取，平均回收率范围为71.0%～125.4%，该方法净化效果和准确度都符合检测要求。

2.5 QuEChERS 技术

QuEChERS（quick easy cheap effective rugged safe）是2002年首次被美国科学家Lehotay等提出的一种基于分散固相萃取技术而形成的样品前处理技术，技术原理与固相萃取相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。GB 23200.113—2018《食品安全国家标准 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》的发布标志着QuEChERS技术为标准检测方法在国内得到应用。该标准采用QuEChERS前处理方法，可以一针同时检测208种农药残留，前处理过程简单高效，且回收率较好，基本在80%以上[16]。与SPE相比，QuEChERS更符合当前农产品农药残留检测形势。QuEChERS的出现对前处理过程起到很重要影响，也出现很多基于QuEChERS技术而优化的方法，包括改变pH、更换配盐、改变溶剂等。这些方法具有简单、高效、快速、安全、价格低廉等显著优点，广泛应用于韭菜农药多残留的检测分析与快速筛查工作中[27-28]。

罗璇[29]应用液氮深冷破碎样品，通过添加分析物保护剂建立基于QuEChERS-GC-MS/MS检测韭菜中60种农药残留的方法。新方法基质效应更低，免去处理空白基质的操作，方法的灵敏度、准确度、精密度及标准曲线和线性范围等指标均符合分析要求，在制备样品，高通量检测，准确定量方面有优势。仲光凤等[30]使用QuEChERS法对韭菜样品进行前处理，结合GC-MS/MS进行检测，外标法进行定量。结果显示，甲拌磷、腐霉利等6种农药在相应的范围内线性关系均良好，相关系数均在0.99以上，6种农药的回收率为87.3%～112.8%，相对标准偏差为7.6%～16.8%，说明该方法灵敏、高效、准确度高，适合韭菜中多数农药残留的快速检测。

3 韭菜中常用杀菌剂残留检测分析方法

随着现代分析化学技术的提高，随着质谱技术的普及和其他预处理技术的快速发展，质谱联用技术被广泛用于农药残留的检测中。韭菜中杀菌剂残留检测主要采用气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和免疫分析技术等。

3.1 气相色谱法

气相色谱法（gas chromatography，GC）是以气体为流动相，通过装有填充剂的色谱柱对样品进行分离测定，具有操作简便、选择性高、分离效能好、灵敏度高、检测限低等特点。对于易挥发且不会发生分解的杀菌剂均可采用气相色谱法进行检测，可以实现一次进样、待测组分得到完全分离的效果，是目前最常用的农药残留检测方法之一。但也存在缺陷，如对热不稳定的农药组分难以分析以及在复杂基质中受干扰使结果出现假阳性或假阴性等。

王晓春等[31]采用QuEChERS前处理技术与气相色谱相结合，建立4种蔬果中16种农药残留的检测方法。通过对色素含量高、基质复杂样品的方法学评价，结果发现各组分在2.0～100 μg/L范围内线性良好，样品平均加标回收率为70.1%～119.0%，相对标准偏差为0.23%～5.2%。该方法具有简便、快速、准确、高效的特点，可用于蔬菜及水果样品中有机氯残留的快速筛查和定量检测。洪泽淳等[32]利用气相色谱法建立韭菜中16种有机磷农药残留检测方法，该方法回收率在77.0%～107.0%之间，相对标准偏差为1.3%～3.2%。该方法具有溶剂用量少、操作简单、效率高等特点。

3.2 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS），是将气相色谱仪与质谱仪串联起来，将气相色谱仪的高效分离能力与质谱仪独特的选择性、灵敏度、相对分子质量和分子结构鉴定能力相结合，以达到待测物的检测具有定性定量等目的。气相色谱-质谱联用技术已被广泛应用于农药残留检测中，特别是在农药代谢物、降解物的检测和多农药残留检测等方面具有显著优势。

张权等[33]将韭菜试样经乙腈提取，采用石墨化炭黑/氨基柱（PC/NH2）净化后，用GC-MS/MS选择离子监测扫描模式（SIM）进行检测，基质匹配溶液外标法定量。结果表明，目标物在65.2～1 043.0 ng/mL范围内呈良好的线性相关。He等[34]采用QuEChERS前处理技术与气相色谱-质谱联用法结合检测韭菜中213种农药残留，采用商业提取盐包，分散固相萃取吸附剂包简化提取程序。大部分农药的检出限为2 μg/kg，相关系数R2＞0.99，平均回收率为70.0%～120.0%，相对标准偏差＜20%，该方法的准确度与灵敏度符合韭菜中农药残留的检测。朱作为等[35]采用QuEChERS快速前处理方法净化，GC-MS/MS测定，建立测定韭菜中百菌清等共51种农药残留的三重串联四极杆气相色谱-质谱联用的方法，运用多反应监测模式进行定性确证和定量分析，提高方法灵敏度，获得较低的检出限。

3.3 液相色谱法

由于气相色谱技术的一些局限，20世纪70年代液相色谱法（liquid chromatography，LC）逐步发展起来，尤其适用于高沸点、热稳定性差、强极性、离子型及大分子化合物的检测分析，在样品的分析中具有载液流速快，重复使用色谱柱，不破坏样品，易于回收等特点。已成为有机杀菌剂残留检测不可缺少的重要方法。

王洁莲等[36]建立同时测定韭菜、大葱中多菌灵、吡虫啉等7种农药残留的液相色谱分析方法。样品经乙腈提取，氨基固相萃取小柱净化，紫外检测器检测，外标法定量。结果表明，在0.03～4.0 mg/L的范围内，7种农药的线性相关系数均大于0.99，检出限为0.006～0.05 mg/kg。禹雪薇[41]提出高效液相色谱法同时测定果蔬中10种防腐杀菌剂的方法，这10种防腐杀菌剂的方法检出限在0.02～0.05 mg/L。研究为食品风险监测领域对蔬菜中农药残留的筛查和确证、风险评估、定量仲裁等研究提供参考依据。

3.4 液相色谱-串联质谱法

液相色谱-串联质谱法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS），是将液相色谱与质谱联接起来用液相色谱将待测物质相继分离，通过质谱仪对检测物质的分离离子的质量片段进行分析检测的方法，用于分析热稳定性差、分子量较大、浓度低、难以用气相色谱分析的化合物，具备明显的多残留检测分析优势。液相色谱-质谱联用法是一种很有利用价值的高效率、高可靠性的农药残留分析技术，具有检测灵敏度高、选择性好、可同时进行定性定量、能够提供待测组分相对分子质量和结构信息等优点。

孙洁等[37]建立超高效液相色谱-串联质谱结合QuEChERS前处理技术同时测定韭菜样品中100种农药残留的方法。方法平均回收率为71.1%～115.6%，相对标准偏差为0.6%～17.0%，该方法高效且稳定，适用于韭菜农残的快速检测和筛查。黄和勇等[38]利用液相色谱-串联质谱法建立韭菜中12种有机磷农药残留检测方法，样品经乙腈提取，固相萃取柱净化，C18色谱柱分离，电喷雾正离子源（ESI+）扫描，多反应监测模式（MRM）进行测定，其检出限为0.02～0.6 μg/kg，满足检测要求。

3.5 免疫分析法

免疫分析法是以抗原抗体可特异性结合原理为基础的分析方法，通过对半抗原或抗体的标记，利用标记物的生物、物理或化学放大作用，对样品中特定的农药残留物进行定性定量检测。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、操作简单、高通量测定等优势，且不需要贵重仪器，可简化前处理过程，目前多用于农药残留的快速定性筛查中。

柳双等[39]基于多菌灵多克隆抗体建立直接竞争酶联免疫吸附测定方法检测果蔬中的多菌灵残留，该方法校正曲线的检测限为0.30±0.15 μg/L，灵敏度为2.70±0.30 μg/L。倪萍[40]利用单克隆抗体建立腐霉利在韭菜中残留的检测方法，该方法线性好，并制备胶体金免疫层析试纸条，该试纸条检测韭菜中腐霉利的最低限为1 μg/kg，具有较高的灵敏度。

4 结语

作为分析工作中非常重要的一环，有机杀菌剂前处理技术不断发展，其中固相萃取和QuEChERS方法以其优越的重现性、准确性和高效性被越来越广泛应用于农药残留检测的样品前处理步骤。固相萃取技术净化效果好，但有材料成本较高、操作复杂、效率较低的劣势。QuEChERS技术优势有回收率高、通用性广、溶剂使用量少、环保、高通量，但也存在净化效果较固相萃取差、基质效应明显、灵敏度不高等问题。后续应继续朝着快速简便、节能环保、准确度高、高通量方向开展研究。在杀菌剂的检测分析方面，色谱法与质谱法联用技术已成为当下农残检测的重要方法，这种检测方法检测灵敏度高、选择性好、定性定量准确，尽管对仪器设备要求较高、不适合现场检测等，但仍是应用广泛、高效可靠的农药残留分析技术。

韭菜属鳞茎类蔬菜，含有含硫化合物且色素含量高。其硫化物性质与农药的性质相似，容易与农药一起被提取出来干扰分析测定。在建立检测方法时，不仅应该考虑目标物的性质，还要兼顾样品的特点。现有的农残检测前处理技术不成熟或者受有效材料等问题局限，在实际应用中存在不足。为提高韭菜中农残提取效率，减小基质效应，样品前处理应从2个方向发展：一是开拓前处理材料的功能化研究，提高萃取能力和选择性；二是增加萃取形式，提高前处理效率。随着科学技术的发展，科研人员也在积极探讨各种高效、先进的前处理方法，不断开发新的检测技术，以满足当前农产品农残检测及生产安全的迫切需求。