肉豆蔻与花椒挥发油复配促渗作用的研究

焦颖，张彦，杨黎燕，刘乐乐，郭文皓

西安医学院（西安 710021）

肉豆蔻和花椒均为“药食同源”品种且性温。肉豆蔻能逐气行滞、开胃消食，对胃肠功能不佳、食欲不振、脾胃虚弱等症状有一定的改善作用[1]。花椒则具有温中降逆的作用，能够改善胃肠不适、腹胀腹痛等不良症状，同时也具有一定的杀菌消炎作用[2-3]。这两种挥发油成分丰富且药理活性广泛，肉豆蔻具有抗菌、抗氧化、抑制炎症功效，可有效地预防皮肤感染、保护皮肤，促进伤口愈合[4]。花椒则具有较好的麻醉和消炎作用，可减轻透皮吸收时的不适感和透皮过程中的炎症反应[5]。

苦参碱是湿疹膏、苦参洗剂等外用制剂中苦参的主要成分，但其碱性较大，亲脂性和透皮吸收作用较差，通常会加入促渗剂使药物透皮吸收率增加[6]。植物挥发油成分复杂，具有多种生物活性成分，有分子量小、脂溶性强、易透过体内生物膜和生物利用度高等特点，通常被作为促渗剂加入外用化妆品及外用药中改善活性成分的透皮吸收效果[7]。但单一植物的活性成分有限，很难达到理想效果，复配能实现功能上的协同、互补[8]，被广泛应用于食品、化妆品等领域。

此试验将肉豆蔻和花椒挥发油进行复配，采用Franz扩散池法，以大鼠腹部皮肤为模拟皮肤，进行体外透皮试验，探究其透皮促渗的效果，有望为肉豆蔻和花椒复配挥发油在透皮促渗作用提供理论依据和试验依据，扩大其在食品香料、化妆品等领域的应用。

1 材料和方法

1.1 材料

肉豆蔻（广东）；花椒（陕西太白县绿润生态农产品有限公司）。

1.2 试剂

纯化水（四川卓越水处理设备有限公司）；苦参碱（≥98%，批号HR21415S1，宝鸡辰光生物科技有限公司）；卡波姆940（99%，广州市欧研化妆品有限公司）；氮酮[含量≥97%，国药控股星鲨制药（厦门）有限公司]；0.9%生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）；乙腈（色谱纯≥99.9%）、无水乙醇（色谱纯≥99.7%）、正己烷（色谱纯≥99.5%）：天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸（含量≥85%，茂名市雄大化工有限公司广州分公司）；异丙醇（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；甲醛（分析纯，西安富力化学厂）。

1.3 主要仪器与设备

RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪（上海黄海药检仪器有限公司）；安捷伦1220LC型高效液相色谱仪（AgiLent TechnoLoies System G42868）；JA2003型分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；挥发油提取器、EP管等。

1.4 动物

SD大鼠，体重200 g，动物证号：SCXK（川）2022-030（成都达硕实验动物有限公司），SPF级西安医学院基转所饲养，使用许可证编号：SYXK（陕）2022-004。

1.5 方法

1.5.1 水蒸气蒸馏法提取植物挥发油

参考文献[4]肉豆蔻碾碎并称取50 g加入10倍量水浸泡2 h，用挥发油提取器提取8 h，得透明色具有清香气味的肉豆蔻挥发油。参考文献[5,8]将100 g花椒碾碎，加入500 mL纯水，用挥发油提取器提取4 h得浅黄色具有清香气味的花椒挥发油。

1.5.2 供试品凝胶的制备

精密称取75 mg苦参碱标准品，置于250 mL的容量瓶中，加水使之溶解并定容，得0.3 mg/mL的苦参碱溶液。称取4 g卡波姆940凝胶基质放入200 mL烧杯中，加入5 mL甘油，搅拌使甘油与卡波姆混匀，再缓慢分次加入200 mL 0.3 mg/mL的苦参碱溶液，搅拌混匀，密封放置，使之充分溶胀，制成200 mL苦参碱凝胶[9-10]。

每份10 mL苦参碱凝胶，共17份。其中，4份加入2%，4%，6%和8%的氮酮，4份加入2%，4%，6%和8%的肉豆蔻挥发油，4份加入2%，4%，6%和8%的花椒挥发油，4份加入2%，4%，6%和8%的肉豆蔻、花椒1∶1复配挥发油，剩余一份作为空白对照，搅拌均匀，密封保存备用。

1.5.3 体外透皮扩散试验

离体鼠皮的制备：将大鼠处死，去除其腹部的毛，迅速剥取腹部皮肤，去除皮下脂肪等组织，用生理盐水反复冲洗直至洗液澄清，剪成面积约5 cm2大小，置于盛有0.9%生理盐水的烧杯中备用[9-10]。

在接收池中加入30%的乙醇生理盐水作为接收液，将处理好的鼠皮固定在扩散池的供给池与接受池之间，用手术剪剪去多余皮肤，真皮一侧与接收液接触，倾斜排尽气泡，并在供给池（扩散面积为3.14 cm2，容积为8 mL）的供给面上均匀涂上供试凝胶。将接收池置于恒温（37±1 ℃）调控磁力搅拌器上，并以恒定的速度搅拌接收液，平行做三组。每隔一定时间从接收池中取出1 mL接收液，并向接收池中补加等量的接收液[9-10]。

1.5.4 高效液相色谱测定苦参碱含量

苦参碱标准品溶液制备：精密称取苦参碱标准品1 mg，加入乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）溶液使之溶解并定容，制成质量浓度为0.1 mg/mL的苦参碱标准品溶液。

色谱条件[10]：选用色谱柱Kromasil NH2柱（5 μm，100 A，250×4.6 mm）；乙腈-无水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10，V/V）作为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温：室温，检测波长220 nm；进样量10 μL。

由1.5.3小节得到的接受液作为样品经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，供HPLC进样分析。测定峰面积值，计算样品中苦参碱的浓度。

1.5.5 高效液相方法学考察

线性关系考察：精密称取0.02 g苦参碱溶于100 mL的容量瓶，用乙腈-无水乙醇定容，得到质量浓度为0.2 mg/mL的苦参碱溶液，再分别吸取5，10，15，20和25 mL 0.2 mg/mL的苦参碱溶液至100 mL容量瓶，加乙腈-无水乙醇稀释至刻度，得到质量浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的苦参碱溶液，摇匀。吸取上述苦参碱溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程[10]。

精密度试验：精密吸取1.5.4小节中质量浓度为0.1 mg/mL的苦参碱标准品溶液，按照1.5.4小节中的色谱条件连续进样6次，记录其峰面积，计算相对标准偏差（SRSD）[10]。

稳定性试验：取含有肉豆蔻挥发油和花椒挥发油各0.3 mL的接受液，与室温下放置，分别在0，4，6，8，10和12 h后按1.5.4小节中的色谱条件进样，记录其峰面积。计算SRSD[10]。

重复性试验：取6份含有浓度为6%的复配挥发油的接受液，1 h后按1.5.4小节中的色谱条件连续进样，记录峰面积。计算SRSD[10]。

1.5.6 累积透过量及透皮速率

将1.5.4小节所得各样品的苦参碱浓度代入式（1）和（2）计算苦参碱单位面积累计透过量Qr（μg·cm-2）和透皮速率Js（μg·cm-2·h-1）[9,11]。

式中：C为t时间的浓度测量值，mg/mL；V为每次取样的体积 mL；S为扩散池有效面积，cm2；T为取样总的时间间隔，h。

1.5.7 皮肤滞留量Qs的测定

按1.5.3小节试验进行4 h后，取下扩散池上的皮肤，用棉签蘸取无水乙醇溶液，擦净表面及背面残留的药物，再将皮肤用剪刀剪碎，用10 mL乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）浸泡3 h，超声提取30 min后，抽滤，浓缩至3 mL，滤液过0.45 μm滤膜，利用HLPC测定峰面积值，计算样品中苦参碱的浓度，即得皮肤滞留量[9,11]。

1.5.8 HE染色观察促渗剂对皮肤组织的影响

将1.5.3小节所得皮肤浸入甲醛固定液中浸泡24 h，乙醇脱水（70% 24 h，80% 24 h，95% 2 h，无水乙醇1.5 h）后，氯仿透明24 h，浸蜡Ⅰ（50～55 ℃）1 h，浸蜡Ⅱ（58～62 ℃）1 h，石蜡包埋（65～70 ℃），冷却凝固成块。将包埋好的蜡块固定于切片机，切成薄片，用乙醇伊红染色液染色2 min，倒置显微镜下观察氮酮与不同浓度、不同种类的挥发油促渗剂对皮肤表皮细胞与细胞间隙的影响[9,11]。

1.5.9 数据与统计

所有数据均用Excel进行统计计算，数据用均数±标准差（）表示，组间比较在进行方差齐性检验后采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 累积透过量

由表1和图1可知，苦参碱的累积透过量均大于空白组，且随透过时间的增加而增加。当促渗剂浓度为6%时，累积透过量最大。不同浓度的氮酮，肉豆蔻挥发油，花椒挥发油，肉豆蔻与花椒1∶1复配挥发油对苦参碱的透皮吸收均有促进作用。当促渗剂浓度为6%或8%时，促渗能力由强到弱依次是肉豆蔻与花椒1∶1复配挥发油＞肉豆蔻挥发油＞花椒挥发油＞氮酮。当促渗剂浓度为2%或4%时，促渗能力由强到弱依次是：肉豆蔻与花椒1∶1复配挥发油＞花椒挥发油＞肉豆蔻挥发油＞氮酮。

图1 累积透过量（μg·cm-2）与浓度，时间关系

表1 累积透过量与浓度、时间关系 单位：μg·cm-2

以渗透时间（h）为横坐标，累积透过量（μg·cm-2）为纵坐标做苦参碱累积透过量与肉豆蔻挥发油浓度及时间关系图，结果见图2。

图2 苦参碱累积透过量与肉豆蔻挥发油浓度及时间关系图

由图2可知，肉豆蔻挥发油浓度为6%时，苦参碱的累积透过量最大，证明此浓度下的肉豆蔻挥发油透皮促渗作用最强，相比较之下，浓度为2%时，累积透过量最小，促渗作用最弱。当浓度为4%和8%时，苦参碱的累积透过量未见明显差距。

以渗透时间（h）为横坐标，累积透过量（μg·cm-2）为纵坐标做苦参碱累积透过量与花椒挥发油浓度及时间关系图，结果见图3。

图3 苦参碱累积透过量与花椒挥发油浓度及时间关系图

由图3可知，随着时间的变化，苦参碱累积透过量不断增加，前3 h透皮效果有明显差异，3 h后，浓度为2%和8%的花椒挥发油促渗效果未见明显差距，浓度为4%和6%的花椒挥发油促渗效果也接近，但促渗作用远远大于浓度为2%和8%的花椒挥发油。

以渗透时间（h）为横坐标，累积透过量（μg·cm-2）为纵坐标做苦参碱累积透过量与肉豆蔻，花椒1∶1复配挥发油浓度及时间关系图，结果见图4。

图4 苦参碱累积透过量与肉豆蔻，花椒1∶1复配挥发油浓度及时间关系图

由图4可知，随着时间的变化，苦参碱累积透过量不断增加，且当肉豆蔻与花椒1∶1复配挥发油浓度为6%时，累积透过量最大。当浓度为8%时，累积透过量虽有所减少，但仍比其他浓度的累积透过量大。

以渗透时间（h）为横坐标，累积透过量（μg·cm-2）为纵坐标做苦参碱累积透过量与氮酮浓度及时间关系图，结果见图5。

图5 苦参碱累积透过量与氮酮浓度及时间关系图

2.2 透皮速率

由表2可知，透皮1 h后，透皮速率均呈现下降趋势。不同种类的促渗剂均在浓度为6%时，透皮速率最快。当加入促渗剂的浓度大于6%时，不同种类促渗剂的透皮速率由快到慢的顺序是肉豆蔻与花椒1∶1复配挥发油＞肉豆蔻挥发油＞花椒挥发油＞氮酮；当加入促渗剂的浓度小于6%时，不同种类促渗剂的透皮速率由快到慢的顺序是肉豆蔻与花椒1∶1复配挥发油＞花椒挥发油＞肉豆蔻挥发油＞氮酮，且不同浓度促渗剂的透皮速率均大于空白组。

表2 透皮速率与浓度、时间关系 单位：μg·cm-2·h-1

2.3 皮肤滞留量QS

以促渗剂浓度为横坐标，皮肤滞留量（μg/mL）为纵坐标做图，结果见图6。

图6 苦参碱皮肤滞留量与促渗剂种类及浓度关系图

图7 不同促渗剂对大鼠腹部皮肤的影响（HE染色，x100）

由表3与图6可知，不同浓度挥发油、氮酮的皮肤滞留量远远小于空白组。当加入花椒挥发油的浓度为2%，6%和8%时，苦参碱的滞留量与其他促渗剂相比有显著的差距，从减少苦参碱滞留量方面考虑，花椒挥发油具有较好的促渗作用。

表3 皮肤滞留量与浓度关系 单位：μg/mL

2.4 促渗剂对皮肤组织的影响

空白组皮肤结构完整，角质层完好无损，表皮细胞排列紧密[13]。与空白组相比，加入促渗剂可以增大细胞间隙，对角质层有明显作用，植物挥发油对角质层破坏远低于化学促渗剂氮酮。花椒挥发油，肉豆蔻挥发油，复配挥发油均可使皮肤角质层细胞间隙明显增大，花椒挥发油使细胞间隙略有增大但角质层脂质仍排列整齐，故花椒挥发油促渗对皮肤角质层破坏较小。花椒挥发油和肉豆蔻挥发油复配后细胞间隙增大最为明显，且角质层结构较为完整，并未完全破坏角质层的有序排列[7]，故肉豆蔻与花椒复配挥发油可提高皮肤通透性，促进药物透皮吸收。

2.5 高效液相方法学考察

加样回收率试验：取已知含有量的接受液6份，精密量取1 mL，加入0.1 mg/mL的苦参碱标准品溶液2 mL，混匀，量取10 μL按1.5.4小节中的色谱条件进样测定，计算加样回收率。

标准曲线的绘制：按1.5.5小节线性关系考察方法依次进行测定，绘制苦参碱标准曲线如图8所示。

由图8知，苦参碱回归方程为Y=4 143.1X+1.277 2，R2=0.999 3线性范围0.01～0.05 mg/mL，在线性范围内线性良好。

精密度试验：按1.5.5小节精密度试验方法依次进行测定，得到苦参碱峰面积分别为415.096 3，425.456 8，424.783 5，408.658 4，401.845 9和406.485 6，苦参碱平均峰面积为413.721 1，SRSD为2.16%。结果表明该仪器具有良好的精密度。

稳定性试验：按1.5.5小节稳定性试验方法依次进行测定，苦参碱峰面积分别为17.045 3，16.048 2，23.453 6，22.387 5，19.483 1和24.987 5，12 h内苦参碱平均峰面积为20.567 5，SRSD为1.75%，表明接受液在12 h内稳定性良好。

重复性试验：按1.5.5小节重复性试验方法依次进行测定，苦参碱含量分别为0.015 7%，0.015 2%，0.016 3%，0.015 5%，0.015 4%和0.014 9%，苦参碱的平均含量为0.015 5%，SRSD为2.81%，表明重复性良好。

加样回收率试验：按1.5.5小节加样回收率试验方法依次进行测定，苦参碱的回收率分别为100.6%，98.55%，97.25%，98.90%，101.55%和98.95%，其平均回收率为99.30%，SRSD为1.54%。表明该方法回收率好。

3 结论与讨论

此研究发现挥发油能够大幅改善苦参碱的透皮效果，显著地提高药物在皮肤中的渗透速率，这可能与其改变皮肤角质层的通透性有关。皮肤角质层致密的网络结构是活性成分经皮吸收的主要屏障，当其所含脂质成分及角蛋白结构构象等发生变化时，可导致其通透性及屏障作用改变[12]。王茵等[8]通过对比不同浓度、不同种类的植物挥发油对苦参碱透皮促渗效果的影响，结果发现肉豆蔻和花椒挥发油复配使用后的促渗效果显著优于单一使用。有人研究温热药性对挥发油透皮促渗剂皮肤毒性的影响及其机制研究，指出热性药挥发油的皮肤细胞毒性显著大于温性药挥发油，皮肤刺激性却没有显著性差异，但两者均远低于经典的化学促渗剂氮酮[12]。采用挥发油复配的思路即可提高透皮促渗的效果，又可避免细胞毒及刺激性的问题[8]。此研究提出的肉豆蔻和花椒挥发油复配的解决方法具有一定的创新性。

此研究确定了肉豆蔻挥发油和花椒挥发油对苦参碱透皮促渗吸收的最佳浓度，有较强的应用推广和深入研究的价值。肉豆蔻和花椒药食同源，安全无毒[14]，其挥发油可作为原料添加到化妆品，及外用药中做促渗剂。故未来研究仍需进一步探索肉豆蔻、花椒挥发油复配后透皮促渗的作用机制及成分变化，也需从抗炎、抗感染、扩张皮肤血管等多角度深入研究复配挥发油的生物活性[13-14]。将植物复配挥发油用于食品添加剂和化妆品中促渗，是一种可提高治疗效果的有效策略。