H型血管促进成血管-成骨耦联在骨折愈合中作用机制的研究进展*

卢承印, 罗志强, 简功辉, 齐新宇, 熊 辉△, 李汪洋

1湖南中医药大学第二附属医院骨伤科,长沙 410005 2湖南中医药大学第二中医临床医学院,长沙 410005

人体骨骼具有显著的再生特性,是身体中少数几个可以重建其正常细胞组成、方向和机械强度的结构之一[1]。但因受到损伤程度、感染、局部血供以及患者年龄等因素的影响,临床上仍有5%～10%的骨折患者会出现延迟愈合或不愈合[2]。这种情况一旦出现,往往需要多次手术治疗,给患者带来极大的痛苦和高额的治疗费用。因此,深入了解骨骼再生的具体机制,促进骨折愈合,是骨伤科领域重点研究的课题。

骨折愈合是一个多环节参与的复杂的修复过程,受众多因素的影响。研究发现[3],在骨折愈合的过程中,血管生成和骨生成之间存在复杂的相互作用,二者以密切的时空和相互依赖的方式耦合:成骨细胞能够分泌血管生长因子以促进血管生长并影响其功能,而血管内皮细胞能够释放血管分泌信号以调节骨骼的重塑和修复。这种血管生成与骨生成之间密切的关系被称为“成血管-成骨耦联”[4]。随着2014年Kusumbe等[5]首次报道在小鼠长骨中鉴定出一种具有诱导骨形成能力的特殊血管亚型,即H型血管,进一步丰富了成血管-成骨耦联的作用机制。研究表明,H型血管可以通过刺激骨髓中骨祖细胞增殖和分化,并分泌细胞因子来积极引导骨形成,进而促进骨折愈合[6-7]。因此,深入研究H型血管的功能将为骨折愈合提供新的见解和思路。基于此,本文通过在中国知网(CNKI)数据库中以(“H型血管”)AND(“血管新生”OR“骨形成”OR“成血管-成骨耦联”)为主题词进行检索,在PubMed数据库中以(“H-type vessels”OR“type H blood vessels”)AND(“Fracture”OR“Angiogenesis”OR“Osteogenesis”OR“Angio-osteo coupling”)为MeSH词和自由词组合进行文献检索。经过筛选和详细阅读检索到的文献,对H型血管参与成血管-成骨耦联的作用机制及调控H型血管新生的相关分子与信号通路进行综述,以期为骨折的临床治疗和机制研究提供参考。

1 H型血管的定义与特点

血管由多种细胞组成,其中内皮细胞在血管发生和血管形成的过程中发挥着核心调节作用。2014年Nature杂志首次报道[5],根据内皮细胞的形态、表面标记物染色结果以及功能特征,从小鼠的干骺端和骨髓腔的毛细血管中鉴定出两种不同的血管亚型,分别为高表达血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1/CD31)及唾液糖蛋白内粘蛋白(EMCN)的H型血管和低表达CD31及EMCN的L型血管。其中H型血管主要分布于干骺端和骨内膜下,通过远端血管弓相互连接,类似于直柱状;而L型血管主要分布在骨干区域,在骨髓腔中显示出高度分支的毛细血管网。两种类型的血管在骨骺与骨干的连接处紧密相连,并在骨髓腔中形成一个完整的血管床。富氧血液从动脉入骨后,先流入H型血管,随后流入骨骺与骨干连接处的L型血管,最终流入中央静脉[8]。

研究发现,虽然H型血管内皮细胞仅占所有内皮细胞的1.77%和全部骨髓内皮细胞的0.015%,但超过70%的Osterix+成骨祖细胞、82%的Runx2+早期成骨细胞以及胶原蛋白1α+型成骨细胞、PDGFRβ+血管周细胞等骨祖细胞选择性地分布在H型血管周围[5],从而产生成骨细胞和骨细胞促进骨形成。而在L型血管周围几乎没有骨祖细胞的分布[9]。此外,H型血管有高度分化成动脉的趋势,这些动脉为骨缺损区域的局部血管网络提供必要的营养,以满足骨缺损区域成骨的代谢需求[10-11]。这些研究结果均表明,相较于L型血管,H型血管在成骨方面发挥着更为重要的作用。

2 成血管-成骨耦联机制

成血管-成骨耦联机制是指在骨组织形成和修复过程中,血管新生和骨组织生成之间的相互作用的关系。骨是一种高度血管化的组织,其发育、成熟、重塑和再生依赖于血供的严格调节[12],在各类器官中血管生成是发生最早的事件之一,骨折后血供的好坏更直接影响骨的修复过程,影响其愈合速度。骨形成和骨改建均离不开血管生成,二者在时空上相互耦合:在时间上,血管新生早于骨形成,血管入侵是骨形成及矿化的前提条件;在空间上,新生血管为骨组织提供氧气、激素、营养物质,调节骨骼的重塑和修复,还能清除骨细胞代谢所产生的废物。而骨组织也可以影响血管的形成和功能,在骨组织中,成骨细胞会分泌一系列的细胞因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。这些细胞因子可以影响血管内皮细胞的增殖和分化,促进血管的形成,同时,它们也可以影响血管的功能,如调节血管的收缩和扩张,维持血管的通透性等。总之,成血管-成骨耦联机制是指血管和骨组织之间的相互作用关系,这种相互作用关系可以促进骨组织的生长和修复,同时也可以影响血管的形成和功能,是骨组织再生和修复的重要机制之一[13]。

3 H型血管在成血管-成骨耦联中的作用机制

H型血管作为一种毛细血管亚型,能够与多种骨细胞相互作用,从而促进成血管与成骨之间的耦联。首先,尽管H型内皮细胞在内皮细胞中所占的比例较低,但骨组织中的关键细胞群,如Osterix+成骨祖细胞、Runx2+早期成骨细胞、胶原蛋白1α+型成骨细胞和PDGFRβ+血管周细胞等选择性地位于H型血管周围,表明H型血管是促进骨再生的关键因子[5]。其次,H型血管内皮细胞能够释放出包括促进成骨细胞分化、增殖和骨基质合成的信号分子,以及调节血管生成和功能的生物活性分子,如Noggin和VEGF等。这些分子可能对周围的骨组织细胞产生影响,刺激骨祖细胞的增殖和分化以调节成骨,从而在成血管-成骨耦联中起到调节作用[14]。此外,H型血管作为特殊的血管类型,能够在发育过程中分化为动脉,这些动脉的形成是骨组织中局部血管网形成的基础,同时提供必要的营养,以满足骨缺损区域成骨的代谢需求[11]。这些结果表明,H型血管在介导血管生长、维持其周围成骨谱系细胞数量以及在成骨和血管生成耦联方面发挥着重要作用。

4 调控H型血管生成促进成血管-成骨耦联的相关分子机制

由于H型血管在骨再生过程中具有促进成血管-成骨耦联的能力,因此在骨折治疗过程中调控H型血管生成,促进骨折区域H型血管增加,成为一种有前景的治疗方法。迄今为止,HIF-1α、Notch、PDGF-BB、SLIT3等多种信号通路与分子,已被证明通过调控H型血管新生,参与到成血管-成骨耦联的作用机制当中。见图1、表1。

表1 部分调控H型血管促进成血管-成骨耦联的药物或干预方法Table 1 Partial regulatory drugs or interventions that promote angiogenesis-osteogenesis coupling in type H blood vessels formation

4.1 低氧诱导转录因子-1α

低氧诱导转录因子-1(hypoxia-inducible transcription factor-1,HIF-1)是一种介导细胞对氧气变化反应,控制生理和病理新生血管生成的异源二聚体转录因子[25],由α亚基和β亚基组成,其中HIF-1α亚基的表达和活性受细胞内氧浓度的调节。在富氧环境中,抑癌蛋白pVHL可与羟基化的HIF-1α结合,随后在Fe2+和氧气的作用下降解,而在低氧状态下,pVHL失活,从而影响HIF-1α的降解,导致HIF-1α表达增加,进而与HIF-1β结合形成HIF-1[26]。HIF-1作为一种转录因子,能够与低氧反应元件结合,反式激活血管内皮生长因子(VEGF)等下游靶基因的表达,参与到调控血管新生的过程当中。

研究表明,HIF-1α是H型血管形成的重要启动因子,在成血管-成骨耦联中发挥关键作用[27]。Kusumbe等[5]研究发现,当小鼠HIF-1α基因敲除后,胫骨干骺端和骨内膜的H型血管表达显著减少,而内皮细胞VHL基因的特异性敲除后,能够使H型血管新生及骨小梁形成增加,并增加更多数量的Runx2+和Osterix+骨祖细胞。进一步研究发现,甲磺酸去铁胺可促进HIF-1α的活性和稳定性,显著增加H型血管的表达。此外,Li等[15]制备了一种含生物活性脂质的超临界CO2泡沫复合支架(FTY/MBG-PLGA),通过激活Erk1/2通路显著上调HIF-1α的表达,并使H型血管的形成显著增强,从而将血管生成与成骨结合起来,实现满意的血管化骨再生。以上研究均表明,HIF-1α在调节H型血管生成,促进成血管与成骨间的耦联中发挥着至关重要的作用。

4.2 Notch信号通路

Notch信号通路是一条高度保守且广泛参与细胞通讯和发育的信号传导通路,主要通过Notch受体(Notch1～4)和其配体(DLL1、3、4和Jagged1、2)之间的相互作用来传递信号[28]。尽管在大多数组织中,Notch信号激活可能通过抑制促血管生成因子的表达来抑制血管的出芽,从而对血管形成产生负面调节[29-30]。但最新研究发现[31-33],在骨组织中,Notch信号通路与骨微环境血管生成正向相关,可促进小鼠长骨中血管内皮细胞的增殖和血管生成。Ramasamy等[16]的实验研究证明,对小鼠使用Notch受体失活剂(Fbwx)干预,能够增加信号传导,使H型血管、Runx2+骨祖细胞的数量及内皮细胞Noggin蛋白的分泌增加,Noggin蛋白作为骨形态发生蛋白的抑制剂,能够促进成骨细胞的增殖分化和软骨细胞的成熟肥大。而通过减少DLL4配体,对Notch信号进行传导抑制,则会导致H型血管、Runx2+骨祖细胞及Noggin蛋白表达减少,使成骨细胞分化、骨形成和软骨内骨化也被阻断。由此表明,Notch信号通路在直接促进H型血管生成以及促进成血管-成骨耦联中发挥重要作用。

4.3 血小板衍生生长因子-BB

血小板衍生生长因子-BB(platelet growth factor BB,PDGF-BB)是PDGF家族中的一种趋化和有丝分裂因子,主要由巨噬细胞(尤其是M2亚型)和破骨前体细胞分泌,能促进内皮祖细胞和间充质干细胞的迁移、增殖和分化,对促进血管生成和成骨至关重要[34]。研究表明,PDGF-BB通过与间充质干细胞和内皮祖细胞表面的受体PDGFRβ结合,激活PI3K/Akt信号通路,进而调节其迁移、分化和矿化,调控血管生成和成骨[35]。当发生骨缺损时,单核细胞/巨噬细胞谱系细胞如酒石酸盐抗性酸性磷酸酶阳性(TRAP+)单核细胞和成骨细胞移动到骨缺损区域并分泌PDGF-BB,从而诱导骨膜衍生细胞(PDC)的表达和募集到骨膜表面,以支持血管和骨的形成[36]。

PDGF-BB是H型血管生成的关键因子[37]。Xie等[35]的研究表明,PDGF-BB在骨形成过程中促进了H型血管的形成,通过局部给予PDGF-BB或刺激破骨前体细胞分泌PDGF-BB可显著增加H型血管内皮细胞的数量,而当PDGF-BB在成年小鼠中的表达水平降低时,H型血管的数量显著减少,同时骨小梁和皮质骨量减少。Huang等[17]对骨质疏松模型小鼠使用β-咔啉生物碱(去氢骆驼蓬碱)治疗,发现其能通过增加破骨前体细胞的数量和外源性PDGF-BB,促进H型血管的生成,从而诱导血管生成与骨形成的耦联,促进骨再生。Shen等[18]的实验研究也显示,中药提取物骨碎补总黄酮可通过PDGF-BB/PDGFR-β轴促进H型血管形成,从而增强牵张成骨过程中的成血管-成骨耦联,促进骨折愈合。以上研究表明,PDGF-BB在促进H型血管生成及成血管-成骨耦联机制中发挥重要作用。

4.4 神经轴突导向因子3

神经轴突导向因子(slit guidance ligand 3,SLIT3)属于SLIT家族,是一种结构上高度保守的大分子分泌性糖蛋白,最早在中枢神经系统发育过程中发现,能够调控神经轴突的定向生长[38]。SLIT3主要通过与靶细胞表面的受体ROBO(Roundabout)蛋白家族相互作用来发挥功能[39]。研究发现,除神经系统以外,SLIT3在脑、心脏、骨骼肌、脐静脉等其他组织中也广泛分布[40-41],并参与额外的生理功能,如血管生成等,是一种有效的促血管生成因子[42]。

Xu等[6]的研究显示,SLIT3通过与其内皮细胞上的受体ROBO1结合,直接靶向骨H型血管来间接促进骨形成速率及骨量累积。在成骨细胞SHN3调节蛋白(成骨细胞活性抑制剂)特异性敲除的小鼠中发现SLIT3的表达增加,并表现出更好的骨形成和更高的H型血管表达,同时观察到骨折愈合加速,而通过外源性SLIT3的给药也能够增加小鼠H型血管的数量,促进骨折愈合并防止骨丢失[43],表明成骨细胞来源的SLIT3能够调节H型血管的表达,进而促进骨再生。Kim等[44]的研究则发现,破骨细胞分泌的SLIT3也能够刺激成骨细胞募集和增殖进入骨重塑位点,增强成骨作用,敲除破骨细胞中的SLIT3会表现为H型血管减少,破骨细胞生成增多以及骨量降低。但与Kim研究结果相反,Li等[45]的研究结果显示,破骨细胞并非SLIT3的主要生成来源,破骨细胞本身和其分化过程中并不产生SLIT3,且破骨细胞中SLIT3的条件性缺失对破骨细胞祖细胞的数量、体外破骨细胞分化、总骨量或骨吸收/形成没有影响。以上研究表明,虽然SLIT3在骨中的来源尚存在争议,但靶向SLIT3信号通路的确能够调节H型血管生成,并促进成血管-成骨耦联。

4.5 血管内皮生长因子

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是促进血管生成的经典因子,包含有VEGFA、B、C、D以及胎盘生长因子(placenta growth factor,PLGF)等5种亚型,其中VEGFA型的成血管能力最强,也是目前研究最为充分的亚型。VEGFA通过与VEGFR2受体结合,促进内皮细胞的增殖和迁移。在骨髓中,VEGF可由软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞以及免疫细胞等分泌,并受到HIF-1α、PDGF-BB、Noggin等多种细胞因子和转录因子的调控,在成血管-成骨耦联机制中发挥重要作用。Chen等[19]的研究显示,人参皂苷Rg1能够促进骨祖细胞分泌VEGF,激活Noggin/Notch通路,增加H型血管生成以及骨形成,并促进血管生成和成骨的耦联。Wei等[20]对大鼠胫骨骨折模型采用土鳖虫贴敷的方法治疗,结果显示该方法能够通过激活VEGF/ERK1/2信号通路,增加胫骨骨痂处血管数量(CD31阳性)和面积,促进骨折愈合。以上研究均表明,VEGF在促进H型血管形成以及成血管-成骨耦联机制方面发挥重要作用。

4.6 干扰素基因刺激因子

干扰素基因刺激因子(the stimulator of interferon genes,STING)是先天免疫的关键因素之一,其主要功能是在检测到细胞内的DNA病毒感染或细胞内DNA损伤时,激活免疫反应以保护机体免受感染和疾病的侵害。近年来多项研究表明STING与血管生成及骨形成之间存在关联[46-48]。Chen等[21]的研究显示,在STING激活后,炎症反应延长,H型血管生成减少,同时体内骨愈合过程减缓,而STING的抑制剂H-151或C-176则能够增强H型血管的形成,加速骨愈合。以上研究表明,适度抑制STING的激活可能是一种潜在的免疫疗法,可以通过增强H型血管形成进而促进成血管-成骨耦联,促进骨愈合。

4.7 其他可能的影响因素

除以上相关分子及信号通路外,还有一些因子或干预方式也被发现可能具有调控H型血管生成,促进成血管-成骨耦联的作用。Xu等[49]的研究显示,低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)能够显著增加脊柱融合过程中成骨细胞的数量,并伴有H型血管生成的增加。Bai等[23]的研究表明,低强度激光(low level laser therapy,LLLT)在促进干细胞成骨分化和血管生成中起重要作用,能够促进H型血管和骨组织的形成,通过耦合血管生成和骨生成来增强骨修复和再生。此外,还有研究显示,感觉神经在血管生成和骨生成之间具有重要作用[50],其中感觉神经蛋白信号素3A(Semaphorin3A,Sema3A)与H型血管密切相关,Sema3A在骨形成区域高表达,同时与H型血管在骨形成的整个过程中紧密共定位,且Sema3A的出现早于血管生成,表明H型血管的生成很可能受Sema3A的调控[51]。同时有研究证实通过在胶原支架中添加元素硅(Si)能够刺激感觉神经分泌Sema3A来促进血管化骨再生[24]。除以上几种因子和方式外,机械负荷[52]、RANKL-RANK信号通路[53]、基质金属蛋白酶(MMPs)[22]等也被发现具有调控H型血管生成和促进成血管-成骨耦联的作用,但以上干预方式仍有待进一步研究以阐明其发挥作用的具体机制[54]。

5 小结与展望

综上所述,自2014年H型血管首次被鉴定并发现在成血管-成骨耦联中具有重要作用以来,越来越多的骨科领域的学者们开始研究其作用机制并挖掘能够调控H型血管生成,促进成血管-成骨耦联的相关药物及干预手段,从而为促进骨折愈合提供新的思路和方法。随着研究的不断深入,HIF-1α、Notch、PDGF-BB等调控H型血管生成的信号通路和细胞因子作用机制已逐渐明确,相关药物和治疗方法也随之研发。此外,除骨折领域外,H型血管的作用机制也被应用于骨质疏松、骨关节炎以及股骨头坏死等骨科相关疾病的发病机制和治疗中进行研究,通过调节H型血管的生成,可以优化骨组织的血供,促进受损骨组织的修复和再生。这表明,H型血管深入研究有望为这些骨科疾病带来新的治疗策略,进一步拓宽其在医学领域内的应用范围。

然而,尽管我们对H型血管的作用有了更深的认识,在这个领域仍有许多的未知和挑战。首先,血管生成和骨生成是一个多靶点多通路的复杂网络,目前关于促进H型血管生成的研究多集中在单一靶点或通路,因此还需要进行多靶点多通路的协同干预研究,从而实现骨折愈合的多方位调控,以期达到更好的治疗效果。其次,对于各种信号通路和细胞因子影响H型血管生成的机制尚未完全明确,例如调控H型血管生成的SLIT3因子来源还存在争议等,因此还需要通过更多的分子生物学和细胞生物学研究来进一步阐明。此外,目前针对H型血管促进成血管-成骨耦联的相关研究大多仍局限于动物实验,未来将这些动物实验的成果转化到人类患者,仍需开展更多的临床前研究,以评估其安全性和有效性。

随着相关研究的不断深入,对H型血管在骨折愈合过程中促进成血管-成骨耦联的机制将会进一步明确,各种促进H型血管生成的因子和通路之间的协同效应以及它们如何在骨折愈合早、中、晚期不同阶段和不同环境(低氧、炎症或机械压力)中发挥作用,将为骨折愈合提供更为精确和个性化的治疗策略。同时,随着生物材料和组织工程技术在骨折领域的快速发展,通过3D打印、硅化胶原支架、超临界CO2发泡等技术制造的新型的支架材料,不仅能够提供骨折部位所需的机械支持,同时有利于细胞粘附、增殖和迁移,并通过负载的药物或生物活性因子调节血管生成和成骨。因此,将这些生物组织工程材料与H型血管的作用机制进行结合,通过多学科交叉的创新方法研究骨折愈合和骨科疾病治疗,将会为骨科疾病的治疗提供新的思路。

总之,随着未来学者们对H型血管作用机制的深入探索和理解,各种调控H型血管生成以促进成血管-成骨耦联的药物和治疗策略的研发,将有望成为临床促进骨折愈合的一个重要方向。