孕早期血清微量元素水平与胆汁酸代谢及妊娠期糖尿病关联的巢式病例-对照研究*

李洁梅, 伍 莉, 李娟华, 覃 宁, 冯宝莹, 彭 阳, 李 涵△

广西医科大学公共卫生学院 1卫生化学教研室 3环境卫生学教研室,南宁 530021 2广西壮族自治区妇幼保健院,广西儿科疾病临床医学研究中心,南宁 530028

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一种严重威胁母婴健康的妊娠期疾病[1]。2018年的一项Meta分析结果显示我国GDM患病率为14.8%[2],而2020年的一项研究显示在全面二孩政策实施后GDM患病率上升至21%[3]。GDM发病率居高不下,目前已有研究表明微量元素稳态失衡可能是引起GDM的重要危险因素[4]。动物研究发现,微量元素如硒(Se)、锌(Zn)、铬(Cr)可调节机体的胰岛素敏感性,在维持血糖稳态中发挥重要作用[4]。也有许多流行病学研究报道了微量元素如锌、铜(Cu)、锰(Mn)与GDM的发生风险有关[5-7],但研究结果尚不一致。另外,目前对于孕妇体内其他微量元素水平如钒(V)、钼(Mo)和钴(Co)与GDM发生风险之间研究有限。

关于GDM的发病机制尚未完全清楚,有研究表明GDM的发生可能是体内多条代谢通路复杂相互作用的结果,代谢物可直接或间接地参与调控胰岛素敏感性[8]。有研究发现血清胆汁酸代谢异常先于2型糖尿病的发生[9],且胆汁酸代谢和信号通路的改变与肥胖和2型糖尿病相关[9-10]。也有流行病学研究发现,妊娠期血清总胆汁酸(TBA)、脱氧胆酸(DCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)浓度升高与GDM风险增加相关[11-13]。此外,毒理学研究发现某些微量元素,如铬暴露可干扰胆固醇代谢,包括初级胆汁酸和与微生物相关的次级胆汁酸代谢[14]。然而,微量元素是否通过影响母体胆汁酸代谢进而导致GDM,目前尚不清楚。

因此,本研究基于前瞻性出生队列,采用巢式病例-对照研究设计分析孕早期血清微量元素水平与GDM的关联及其对母体胆汁酸代谢的影响,并探讨胆汁酸在微量元素与GDM之间的中介作用,从而为GDM的防控提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究基于广西壮族人群出生队列研究,选取2015年6月至2019年7月期间在广西南宁市武鸣区人民医院招募的孕妇,纳入标准为:(1)初检孕周≤12周;(2)预计在定点医院分娩;(3)同意提供血液样本。排除标准:(1)未追踪到妊娠结局;(2)分娩死胎、出生缺陷儿或多胎妊娠。根据孕妇在怀孕第24～28周接受的口服葡萄糖耐量测试(OGTT)结果,参照美国糖尿病协会2023年最新发布的诊断标准进行GDM诊断[1],即当满足或超过以下任何一种血糖值时,可诊断为GDM:空腹血糖≥5.1 mmol/L;服糖后1 h血糖值≥10.0 mmol/L;服糖后2 h血糖值≥8.5 mmol/L。本研究采用巢式病例-对照研究设计,共纳入124例GDM病例,按年龄和孕周(±1)进行1∶1个体匹配,最终共纳入248名孕妇。所有研究对象均签署了知情同意书,本研究已获得广西医科大学伦理委员会批准(伦理审批号:20140305-001)。

1.2 方法

1.2.1 孕妇基本信息采集 在孕妇进行首次产检时,由经过培训的调查员对其进行面对面的问卷调查。问卷的具体内容包括:孕妇基本情况(年龄、职业、民族、身高体重等情况);生活方式(妊娠期间饮酒和吸烟、被动吸烟等);通过查询病历系统收集孕妇的疾病史、血糖值、孕周等信息。孕妇在孕周≤12周进行产前检查时,采集孕妇空腹静脉血5 mL,离心提取血清,置于冻存管中,放置于-80℃冰箱冷冻保存。

相关定义:孕前体质量指数(BMI)为孕前体重(kg)/身高的平方(m2)。工作情况:指孕妇是否处于就业状态。饮酒:指孕妇在妊娠期间是否有饮酒行为。吸烟:指孕妇在妊娠期间是否有吸烟行为。被动吸烟:指孕妇在过去3个月身边是否有人吸烟,次数在每周1次及以上。锻炼习惯:指孕妇平时是否有每周至少1次,每次至少30 min的规律运动。

1.2.2 血清微量元素浓度检测 本研究采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS,PerkinElmer NexION 350X)分析血清中的微量元素浓度。首先,在4℃下解冻血清样本,加入HNO3,再吸取100 μL样本至15 mL离心管中稀释,超声30 min后静置,置于室温平衡温度,等待上机检测。实验过程中,每20个样品穿插血清质控和血清平行样,微量元素V、Cr、Mn、Co、Cu、Zn、Se和Mo的标准曲线均有较好的线性关系,决定系数(R2)均在0.999以上,加标回收率在80%～120%之间,变异度小于3%。

1.2.3 血清胆汁酸分析 本研究使用超高效液相色谱-串联高分辨质谱(UHPLC-MS/MS,Thermo Fisher Scientific,USA)测定孕妇血清中胆汁酸水平。首先取100 μL血清样品于EP管中,加入400 μL提取液,涡旋混匀;然后超声15 min,-40℃静置1 h后离心15 min;最后取上清液至LC进样瓶中,上机检测。色谱条件,液相色谱A相为乙酸铵水溶液,B相为乙腈。质谱条件,采用平行反应监测(PRM)模式进行质谱分析。所测的31种胆汁酸的标准曲线均有较好的线性关系,回归系数均在0.9958以上,平均回收率在82.4%～105.8%之间,标准相对偏差(RSD)均小于8.3%。

1.3 统计学方法

采用中介效应分析孕早期血清胆汁酸是否在血清微量元素浓度与GDM的关联中发挥潜在作用。中介分析是使用R包“mediation”执行的,设置Bootstrap样本量为5000,当Bootstrap 95%CI不包含0且P<0.05时,则中介效应显著。所有统计分析均使用SPSS 26.0版本和R 4.2.2版本进行,以P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本特征

本研究248名孕妇的平均年龄(31.9±4.6)岁,壮族占总人群的84.7%。与对照组相比,病例组的孕妇有较高的孕前BMI,有较低的就业率和饮酒率(均P<0.05);不同组在产次、被动吸烟、锻炼习惯、糖尿病家族史和高血压家族史方面的差异无统计学意义(均P>0.05),详见表1。

表1 研究对象基本特征或n(%)]Table 1 Baseline characteristics of study subjects 或n(%)]

2.2 孕早期血清微量元素浓度和胆汁酸水平

所检测的248例孕妇血清中Cr的检出率为69.0%,其余元素的检出率均为100%。经Wilcoxon秩和检验分析发现GDM病例组中血清V浓度较对照组高,而Cr、Mn、Zn、Se、Mo浓度低于对照组(均P<0.05),详见图1A。另外,相比于对照组,病例组的牛磺胆酸(TCA)、甘氨熊去氧胆酸-3-硫酸(GUDCA-3S)、甘氨脱氧胆酸-3-硫酸(GDCA-3S)、牛磺脱氧胆酸-3-硫酸(TDCA-3S)、甘氨鹅脱氧胆酸-3-O-β-葡糖醛酸(GCDCA-3Gln)、甘氨去氧胆酸-3-O-β-葡糖苷酸(GDCA-3Gln)水平较高(均P<0.05),其余胆汁酸在两组间差异无统计学意义,详见图1B。

A:自然对数(Ln)转换后血清微量元素浓度;B:自然对数(Ln)转换后血清胆汁酸浓度;与对照组比较,*P<0.05 **P<0.01

2.3 孕早期血清微量元素浓度与GDM发生风险的关系

校正了孕妇年龄、孕前BMI、产次、饮酒、工作情况、孕期被动吸烟和糖尿病家族史因素后,可观察到血清V浓度与GDM的发生风险呈正相关,而血清Cr、Mn、Zn、Se、Mo浓度与GDM的发生风险呈负相关(均P<0.05),详见表2。BKMR模型结果显示,GDM风险呈现先降后升趋势,与所有微量元素浓度都处于中位数时相比,当所有微量元素浓度处于第70和75百分位数时,GDM发生风险显著增加,详见图2。

校正了孕妇年龄、孕前BMI、饮酒、被动吸烟、产次、工作情况和糖尿病家族史因素

表2 孕早期血清微量元素浓度与GDM的关系Table 2 Association between serum trace element concentrations in the first trimester and GDM

血清V和Mo的后验包含概率(PIPs)各为1.00和0.99,表明此两种微量元素在多种微量元素混合暴露的整体效应中占据主导位置,与GDM关联性强。

2.4 GDM与血清胆汁酸代谢物的关系

在OPLS-DA模型中,VIP>1的胆汁酸代谢物具有成为生物标志物的潜力,结果发现有12种胆汁酸代谢物VIP>1,详见表3。进一步使用条件Logistic回归分析孕早期血清12种胆汁酸生物标志物水平及5种不同类型胆汁酸总和[即总胆汁酸(TBA)、总初级胆汁酸(TPBA)、总次级胆汁酸(TSBA)、总游离型胆汁酸(UnconBA)和总结合型胆汁酸(ConBA)]与GDM发生风险的关联。校正孕妇年龄、孕前BMI、产次、饮酒、工作情况、被动吸烟和糖尿病家族史因素后,TCA、甘氨鹅去氧胆酸硫酸(GCDCA-3S)、GCDCA-3Gln、GUDCA-3S、TDCA-3S与GDM发生风险呈正相关(均P<0.05),鹅脱氧胆酸(CDCA)与GDM发生风险呈负相关(均P<0.05)。详见图3。

OR:比值比;CI:置信区间。模型校正了孕妇年龄、孕前BMI、饮酒、被动吸烟、产次、工作情况和糖尿病家族史;*P<0.05

表3 OPLS-DA模型差异胆汁酸代谢物筛选结果Table 3 Results of differential bile acid metabolite screening by OPLS-DA model

2.5 孕早期血清微量元素浓度与胆汁酸水平的关系

采用多重线性回归进行分析,结果发现血清V与牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、GCDCA-3S和GCDCA-3Gln水平呈正相关,与TCA和石胆酸(LCA)水平呈负相关;血清Cr与TUDCA、TCA、GCDCA-3S、TBA和ConBA水平呈负相关;血清Mn与TDCA-3S和TCA水平呈正相关;血清Co与LCA水平呈正相关,与TUDCA水平呈显著负相关;血清Cu与TDCA-3S和TCA水平呈正相关,与CDCA、GUDCA和Uncon BA水平呈显著负相关;血清Zn与熊去氧胆酸硫酸(UDCA-3S)呈正相关,与GCDCA-3S和GCDCA-3Gln呈负相关;血清Se与牛磺石胆酸(TLCA)和LCA水平呈正相关,与TUDCA、GCDCA-3S和TCA水平呈负相关;血清Mo与GUDCA呈正相关(均P<0.05)。详见图4。

校正因素包括孕妇年龄、孕前BMI、饮酒、被动吸烟、产次、工作情况和糖尿病家族史;*P<0.05

2.6 孕早期血清胆汁酸在微量元素浓度与GDM发生风险中的中介作用

孕期血清微量元素浓度和胆汁酸代谢与GDM显著相关,微量元素可能通过影响胆汁酸代谢从而导致GDM的发生。通过中介分析发现GCDCA-3Gln、TCA分别在血清Zn和Se与GDM发生风险的关联中具有显著的中介效应(均P<0.05),其中介比例分别为16.4%和15.5%;另外,未发现血清胆汁酸代谢物在血清V、Cr、Mn与GDM发生风险的关联中存在中介作用。详见图5。

校正因素包括孕妇年龄、孕前BMI、饮酒、被动吸烟、产次、工作情况和糖尿病家族史;在中介效应图中,中间为中介效应比例,底部为总效应(95%CI);*P<0.05

3 讨论

本研究探讨了孕早期微量元素与GDM之间的关联,发现孕早期血清中Cr、Mn、Zn、Se、Mo水平与孕期GDM的发生风险呈显著负相关,血清V水平与GDM的发生风险呈显著正相关。目前已有多项流行病学研究报道了孕期微量元素浓度与GDM的相关性,但结果不一致。目前Cr与GDM的关系研究有限,但Cr与糖尿病之间的关联研究较多,且得到较为一致的结果,即Cr与糖尿病的发生呈负相关[15-16]。Mn是人体必需微量元素之一,关于孕期血Mn水平与GDM的研究有限,且大多数研究未发现两者存在显著性关联[17-18]。但一项同济母婴健康队列发现孕早期Mn水平升高与GDM发病风险增加有关[6]。在普通人群中,韩国的一项横断面研究显示血Mn水平与糖尿病风险的增加呈负相关[19]。中国武汉的一项巢式病例对照研究发现血浆中Zn、Se水平与GDM风险呈负相关[5]。美国一项前瞻性队列研究发现较低的血浆Mo浓度可能会增加妊娠期糖代谢紊乱的风险[20],并且Mo与血糖水平之间呈负相关[21]。对于V与GDM的关联研究尚不明确,中国的一项病例对照研究表明血浆V水平与2型糖尿病之间呈正相关[22];但另一项病例对照研究发现血浆V与GDM呈负相关[23],这种差异可能是由检测的生物基质、研究设计、人群特征以及地域等不同导致。

本研究发现孕早期血清中多种胆汁酸代谢物与GDM之间存在关联。迄今为止,胆汁酸和GDM发生风险及机制的研究证据还比较有限。有研究报道了胆汁酸和2型糖尿病之间的关联。例如,来自芬兰的一项糖尿病预防研究中发现GCA、TCDCA和GCDCA与2型糖尿病的发展呈正相关[24];另一项来自中国成人血清胆汁酸代谢与糖尿病关联的研究发现,TCA、GCDCA、GCDCS与糖尿病发病呈正相关[9]。在孕妇人群中,一项横断面研究发现与健康对照组相比,GDM组中血清GUDCA、TUDCA显著升高,并且可能是GDM的潜在生物标志物[25]。另外上海一项前瞻性队列研究发现孕期8种血浆胆汁酸水平与GDM风险相关,且大多数是初级结合型胆汁酸和次级非结合型胆汁酸,主要包括CA、TCA、GCA、GCDCA、DCA、LCA、UDCA和TLCA可能与GDM相关[26]。在本研究也发现TCA与GDM发生风险相关,与先前研究一致。另外本研究还发现了CDCA、TDCA-3S、GCDCA-3S、GCDCA-3Gln和GUDCA-3S结合型胆汁酸与GDM发生风险密切相关,结合型胆汁酸可能在糖尿病发展的发病机制中发挥重要作用[9]。

近年来,有毒理学研究显示金属暴露会引起动物胆汁酸代谢异常,导致体内胆汁酸水平改变。例如,一项研究对中华蟾蜍幼虫进行Pb和(或)Cu染毒,结果发现总胆汁酸水平、结合胆汁酸与非结合胆汁酸的比率以及各接触组TCA和TCDCA水平发生改变[27]。另外,也有研究发现短期重复接触Mn会导致雄性大鼠在不同时间点血清胆汁酸水平升高[28]。本研究采用中介分析探讨胆汁酸代谢改变在微量元素与GDM中可能的介导作用,发现孕期血清GCDCA-3Gln和TCA分别介导了血清Zn、Se浓度与GDM发病风险的关系,但对于Zn、Se如何通过影响GCDCA-3Gln和TCA从而导致GDM发生的潜在机制尚未清楚。可能原因是胆汁酸是作为葡萄糖和脂质代谢的关键调节因子,可通过激活核法尼醇受体(FXR)和G蛋白偶联受体5(TGR5)来实现[29]。另外,有研究发现TCA可通过激活TGR5受体刺激胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和多肽YY(PYY)从而调节葡萄糖代谢[30];而Zn、Se作为重要的微量元素,可通过增加GLP-1R水平对血糖产生调控作用[31-32]。因此微量元素Zn、Se可能通过影响受体的信号传导进而导致胆汁酸代谢轮廓改变,进而导致葡萄糖代谢失调而引起GDM的发生,但其潜在机制仍需要进一步的研究验证。

本研究优势之一是发现孕早期血清胆汁酸代谢物GCDCA-3Gln、TCA在微量元素Zn、Se与GDM发生风险之间的中介作用,并发现与GDM发生风险相关的潜在胆汁酸标志物,目前尚未见同类研究。其次,本研究基于前瞻性队列研究设计,筛选出的胆汁酸代谢物具有作为GDM早期诊断生物标志物潜力。另外,本研究采用了巢式病例-对照研究设计,避免了选择性偏倚的影响。本研究同时也存在一定局限性:首先本研究中仅采集孕早期血清样本,缺乏多时点重复测量数据。其次本研究样本量较小,且为病例对照研究设计,对微量元素水平与GDM之间因果关系的确定存在一定的局限性。最后,尽管我们控制了一些关键的混杂因素,但其他因素如孕妇教育程度及孕期饮食习惯等,并未被测量。

综上所述,本研究发现孕妇孕早期血清V、Cr、Mn、Zn、Se和Mo多种微量元素浓度与GDM的发生风险显著相关,孕妇孕早期血清结合型胆汁酸代谢物GCDCA-3Gln、TCA可能在微量元素与GDM之间起重要的介导作用。研究结果为阐明微量元素与GDM的关系提供了新的流行病学证据,为探索GDM的发病机制提供了新的思路,同时筛选出的孕早期胆汁酸代谢物具有作为筛选GDM高风险人群生物标志物的潜力。