circFOXK2靶向miR-409-3p调控肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭*

周 方, 王 猛, 程世钊, 王 峥, 卢喜科

天津大学胸科医院胸外科,天津 300222

肺癌发病隐匿,发病率和死亡率较高[1]。circFOXK2被发现在乳腺癌中表达上调,通过竞争性吸附miR-370并上调IGF2BP3的表达促进乳腺癌细胞迁移和侵袭,可作为乳腺癌治疗的分子靶点[2]。研究还显示,circFOXK2在胰腺导管腺癌中也表达上调,促进胰腺癌细胞生长、迁移及侵袭,对胰腺导管腺癌的发生发展起促进作用[3]。但是目前,circFOXK2在肺癌发展中的作用及机制尚不清楚。通过Starbase软件预测,我们发现circFOXK2可能与miR-409-3p互补结合。既往的研究显示miR-409-3p在肺癌组织及细胞系中均表达下调,上调miR-409-3p可通过抑制SPIN1表达降低肺癌细胞的恶性行为,进而延缓肺癌的发展进程[4]。本研究探究circFOXK2是否靶向miR-409-3p调控肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

1 材料与方法

1.1 临床样本

从天津大学胸科医院招募45例肺癌患者,收集手术切除肿瘤获取的癌组织及癌旁组织样本。研究获得了本院伦理委员会的批准并遵循《赫尔辛基宣言》准则。

1.2 细胞和试剂

A549和H1299细胞,中国科学院上海细胞库;胎牛血清、RPMI-1640培养液,美国Gibco;PCR相关试剂盒,日本TaKaRa;LipofectamineTM2000试剂盒,美国Invitrogen;抗体,美国Abcam;CCK-8试剂盒、双荧光素酶试剂盒和BCA试剂盒,北京索莱宝;引物序列、荧光素酶报告基因,上海生工。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR检测 提取总RNA,将其逆转录为cDNA,最后进行PCR反应。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.2 细胞培养 A549及H1299细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液。用LipofectamineTM2000试剂进行细胞转染,分为circFOXK2小干扰RNA组(si-circFOXK2组)、si-NC组、miR-409-3p模拟物组(miR-409-3p组)、miR-NC组、miR-409-3p抑制剂组(anti-miR-409-3p组)、anti-miR-NC组、si-circFOXK2+anti-miR-409-3组、si-circFOXK2+anti-miR-NC组。

1.3.3 双荧光素酶报告基因实验 将wt/mut-circFOXK2和miR-409-3p mimics/miR-NC转染入A549和H1299细胞,使用双荧光素酶试剂盒分析相对荧光素酶活性。

1.3.4 CCK-8法检测 A549和H1299细胞接种于96孔板培养24 h。细胞与CCK-8孵育2 h,酶标仪检测吸光度值,评估细胞存活率。

1.3.5 克隆形成实验 A549细胞接种于6孔板培养14 d。细胞经多聚甲醛固定和结晶紫染色,在显微镜下计数。

1.3.6 Transwell实验 A549和H1299细胞用无血清培养液重悬,接种于预先包被或不包被基质胶的Transwell上室,下室加入完全培养液。24 h后,细胞用多聚甲醛固定,结晶紫染色,并在显微镜下计数。

1.3.7 蛋白质印迹法 提取总蛋白,经过电泳、转膜和封闭后,分别与一抗和二抗孵育。最后使用ECL显影,Image J软件分析灰度值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 circFOXK2和miR-409-3p在肺癌组织中的表达水平

肺癌组织中,circFOXK2水平明显上升(P<0.05),miR-409-3p水平明显下降(P<0.05)。见图1。

A:肺癌组织中circFOXK2高表达;B:肺癌组织中miR-409-3p低表达;*P<0.05

2.2 circFOXK2和miR-409-3p转染效果

si-circFOXK2组A549和H1299细胞中circFOXK2表达低于si-NC组(均P<0.05)。miR-409-3p组A549和H1299细胞中miR-409-3p表达高于miR-NC组(均P<0.05)。anti-miR-409-3p组A549和H1299细胞中miR-409-3p表达低于anti-miR-NC组(均P<0.05)。见图2。

A、D:si-circFOXK2转染效果验证,与si-NC组比较,*P<0.05;B、E:miR-409-3p mimics转染效果验证,与miR-NC组比较,#P<0.05;C、F:anti-miR-409-3p转染效果验证,与anti-miR-NC组比较,&P<0.05

2.3 circFOXK2靶向miR-409-3p

图3A显示了Starbase软件预测的circFOXK2与miR-409-3p的结合位点。A549和H1299细胞共转染miR-409-3p mimics和wt-circFOXK2的荧光素酶活性显著下降(均P<0.05),证实circFOXK2和miR-409-3p存在互作关系,见图3B和3C。si-circFOXK2组A549和H1299细胞中miR-409-3p表达较si-NC组显著升高(均P<0.05),说明circFOXK2负调控miR-409-3p,见图3D和3E。

A:circFOXK2和miR-409-3p的结合位点;B、C:双荧光素酶分析,*P<0.05;D、E:敲低circFOXK2促进miR-409-3p表达,#P<0.05

2.4 circFOXK2和miR-409-3p对肺癌细胞增殖的影响

si-circFOXK2组A549和H1299细胞存活率分别为(59.67±4.38)%、(50.36±5.62)%,克隆数分别为(62.00±2.58)、(46.25±1.96)个;si-NC组A549和H1299细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(100.00±0.00)%,克隆数(121.78±6.03)、(105.32±5.41),si-circFOXK2组较si-NC组均显著降低(A549:t=27.623,P<0.05;t=27.344,P<0.05)、(H1299:t=17.30,P<0.05;t=30.80,P<0.05)。miR-409-3p组A549细胞和H1299细胞存活率分别为(51.90±2.99)%、(40.23±3.24)%,克隆数分别为(52.67±2.05)、(44.35±2.51)个,较miR-NC组[细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(100.00±0.00)%,克隆数分别为(122.22±8.38)、(98.63±5.62)个]均显著降低(A549:t=48.261,P<0.05;t=24.185,P<0.05)、(H1299:t=55.34,P<0.05;t=26.46,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组A549和H1299细胞存活率分别为(85.21±2.81)%、(88.36±4.21)%,克隆数分别为(100.11±7.03)、(89.31±5.42)个,较si-circFOXK2+anti-miR-NC组[细胞存活率分别为(60.21±5.89)%、(55.89±4.68)%,克隆数分别为(60.89±4.23)、(51.23±3.65)个]均显著升高(A549:t=12.026,P<0.05;t=14.341,P<0.05)、(H1299:t=15.47,P<0.05;t=17.48,P<0.05)。见图4。

2.5 circFOXK2和miR-409-3p对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

si-circFOXK2组A549和H1299细胞迁移数分别为(106.11±6.49)、(90.32±5.42)个,侵袭数分别为(88.22±4.61)、(73.62±3.58)个,较si-NC组[细胞迁移数分别为(201.56±9.18)、(172.69±8.51)个,侵袭数分别为(160.11±7.92)、(162.52±5.88)个]均显著降低(A549:t=24.470,P<0.05;t=23.535,P<0.05)、(H1299:t=24.49,P<0.05;t=38.74,P<0.05)。miR-409-3p组A549和H1299细胞迁移数分别为(87.89±4.12)、(74.55±3.56)个,侵袭数分别为(70.78±6.63)、(67.42±5.86)个,较miR-NC组[细胞迁移数分别为(203.00±11.33)、(175.62±10.54)个,侵袭数分别为(156.67±8.65)、(161.75±6.58)个]均显著降低(A549:t=28.644,P<0.05;t=23.642,P<0.05)、(H1299:t=27.25,P<0.05;t=32.12,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组A549和H1299细胞迁移数分别为(177.44±6.53)、(184.65±7.58)个,侵袭数分别为(141.00±6.85)、(149.36±7.69)个,较si-circFOXK2+anti-miR-NC组[细胞迁移数分别为(104.56±8.01)、(112.56±8.12)个,侵袭数分别为(84.78±5.20)、(78.62±5.84)个]均显著升高(A549:t=21.156,P<0.05;t=19.611,P<0.05)、(H1299:t=19.47,P<0.05;t=21.98,P<0.05)。见图5和图6。

1:si-NC组;2:si-circFOXK2组;3:miR-NC组;4:miR-409-3p组;5:si-circFOXK2+anti-miR-NC组;6:si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组

1:si-NC组;2:si-circFOXK2组;3:miR-NC组;4:miR-409-3p组;5:si-circFOXK2+anti-miR-NC组;6:si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组

2.6 circFOXK2和miR-409-3p对肺癌细胞中上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达的影响

si-NC组、si-circFOXK2组、miR-NC组、miR-409-3p组、si-circFOXK2+anti-miR-NC组和si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组A549细胞中E-cadherin蛋白表达分别为(0.22±0.03)、(0.56±0.05)、(0.21±0.02)、(0.71±0.06)、(0.56±0.04)和(0.27±0.03),H1299细胞中E-cadherin蛋白表达分别为(0.30±0.03)、(0.65±0.06)、(0.25±0.02)、(0.52±0.05)、(0.63±0.05)和(0.34±0.04)。N-cadherin蛋白表达在A549细胞中分别为(0.70±0.06)、(0.33±0.03)、(0.68±0.06)、(0.22±0.02)、(0.33±0.04)和(0.57±0.05),在H1299细胞中分别为(0.85±0.08)、(0.42±0.05)、(0.78±0.09)、(0.37±0.04)、(0.30±0.03)和(0.69±0.07)。si-circFOXK2组A549细胞中E-cadherin蛋白表达高于si-NC组(t=17.493,P<0.05),N-cadherin蛋白表达低于si-NC组(t=16.547,P<0.05)。si-circFOXK2组H1299细胞中E-cadherin蛋白表达高于si-NC组(t=15.65,P<0.05),N-cadherin蛋白表达低于si-NC组(t=16.55,P<0.05)。miR-409-3p组A549细胞中E-cadherin蛋白表达高于miR-NC组(t=23.243,P<0.05),N-cadherin蛋白表达低于miR-NC组(t=21.820,P<0.05)。miR-409-3p组H1299细胞中E-cadherin蛋白表达高于miR-NC组(t=15.04,P<0.05),N-cadherin蛋白表达低于miR-NC组(t=12.49,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组A549细胞中E-cadherin蛋白表达低于si-circFOXK2+anti-miR-NC组(t=17.400,P<0.05),N-cadherin蛋白表达高于si-circFOXK2+anti-miR-NC组(t=11.245,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组H1299细胞中E-cadherin蛋白表达低于si-circFOXK2+anti-miR-NC组(t=13.59,P<0.05),N-cadherin蛋白表达高于si-circFOXK2+anti-miR-NC组(t=15.36,P<0.05)见图7。

1:si-NC组;2:si-circFOXK2组;3:miR-NC组;4:miR-409-3p组;5:si-circFOXK2+anti-miR-NC组;6:si-circFOXK2+anti-miR-409-3p组;A、E:蛋白质印迹法检测蛋白表达(A:A549细胞,E:H1299细胞);B、F:1、2组中circFOXK2对A549及H1299细胞蛋白表达的影响,与si-NC组比较,*P<0.05;C、G:3、4组中miR-409-3p对A549及H1299中蛋白表达的影响,与miR-NC组比较,*P<0.05;D、H:5、6组中circFOXK2和miR-409-3p对A549及H1299中蛋白表达的影响,与si-circFOXK2+anti-miR-NC组比较,*P<0.05

3 讨论

circRNA是肿瘤进程的重要调控子,对肿瘤发展具有重要影响。既往研究表明,circHIPK3、circ-PRKCI和circ_0046264等均是肺癌中表达上调的circRNA,这些circRNA促进肺癌细胞的恶性表型,敲减其表达有利于延缓肺癌的发展进程[5-7];研究显示circ_EPB41L2、circ_0015278和circ_0001073在肺癌中表达下调,它们在肺癌中起抑癌基因的作用[8-10]。

在本研究中,我们发现circFOXK2在肺癌中表达上调,其敲减降低了肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭。在上皮间质转化过程中,上皮标志物E-cadherin水平下降,而间质标志物N-cadherin水平上升[11],进而导致细胞迁移和侵袭能力增强[12]。在本研究,circFOXK2敲低后,E-cadherin水平上升,N-cadherin水平下降,这进一步证实circFOXK2敲减抑制了细胞迁移和侵袭。circRNA是高度稳定的,且具有组织或细胞类型特异性表达的特点,被认为是有前途的疾病治疗靶标。目前,被称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)的转录后基因调控机制已被确定具有巨大的临床应用潜力,Onpattro注射液是一种siRNA药物,已被批准用于治疗成人患者遗传性经甲状腺视黄醛介导的淀粉样变性(hATTR)引起的周围神经疾病(多神经病变),此外,有50多种基于RNA的药物正在进行临床试验。因此circFOXK2 siRNA可能是用于肺癌临床治疗的有希望的分子。

大量的研究证实了circRNA的miRNA分子海绵作用。例如,circ_0001869在肺癌组织及细胞系表达增加,其通过发挥miR-638分子海绵作用并上调FOSL2的表达促进肺癌肿瘤生长[13]。本研究证实了circFOXK2靶向负调控miR-409-3p。miR-409-3p是乳腺癌、卵巢癌和透明细胞肾细胞癌中表达下调的一个miRNA,上调miR-409-3p可分别靶向抑制TWIST1、Rab10、PDK1的表达降低乳腺癌、卵巢癌和透明细胞肾细胞癌细胞的恶性行为,可作为这些肿瘤治疗的分子靶点[14-16]。本研究结果显示,miR-409-3p在肺癌组织中低表达,其过表达可抑制肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭。与既往的研究结果[17]一致,这些数据表明miR-409-3p作为肿瘤抑制子调控肺癌进程。此外,miR-409-3p抑制剂可以逆转circFOXK2敲减对细胞的影响,这提示circFOXK2可靶向miR-409-3p调控肺癌细胞的恶性行为。

综上,circFOXK2可能是肺癌治疗的潜在靶点,其通过靶向抑制miR-409-3p的表达促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。