人工海水条件下移动床生物膜反应器快速挂膜启动试验

杨吉平 郭黎明 王志 王朋

摘 要：海水循环水产养殖系统中，生物膜反应器的挂膜时间通常较长。为实现人工海水条件下移动床生物膜反应器（moving-bed biofilm reactor，MBBR）滤片的快速挂膜，通过搅拌滤片，采用低成本的海水配方、专用营养液以及选择多样化的菌种等方法和措施进行了试验，并建立了以氨氮、亚硝酸盐氮水平、滤片颜色和孔隙生成物为指标的评估体系。试验结果表明，相比于化学营养组的56 d，发酵营养组经过46 d即完成了挂膜。挂膜过程中氨氮质量浓度最高为20.36～25.12 mg/L，亚硝酸盐氮质量浓度最高为45.28～53.20 mg/L。

关键词：循环水产养殖系统；移动床生物膜反应器；挂膜；人工海水

海洋食物生产发展趋势的预测表明，基于海水养殖技术创新，未来几十年内，人类从海洋中可持续收获的蛋白质产量将大幅增加，海水养殖产量很快将反超捕捞产量，并不断扩大其领先优势［1］。循环水产养殖系统（RAS）被视为应对全球海产品需求增长的可持续解决方案之一［2］。

水产养殖过程中会产生很多含氮化合物，如氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮等，水体中这些含氮化合物的累积往往对养殖对象具有毒性影响，因此在RAS中如何分解这些含氮化合物尤为重要［3］。在商业化的RAS中，由于维护简单和低能耗，移动床生物膜反应器（moving-bed biofilm reactor，MBBR）已成为去除含氮化合物的默认设计选择［3］。MBBR依靠附着在悬浮载体中的硝化细菌等微生物来净化水质，而微生物在载体表面的附着和固定的过程被称之为“挂膜”［4］。成功“挂膜”意味着MBBR具备了持续处理含氮化合物的能力。

高盐度会对微生物产生胁迫，硝化细菌对高盐度非常敏感，加之硝化细菌在含盐条件下生长速度缓慢，因此通常需要较长的时间才能成功挂膜［5-6］。在商业化的RAS中，应用MBBR时通常会出现以下问题：（1）生物膜形成周期长，导致运行成本增加。（2）挂膜期间RAS中累积的含氮污染物可能会对养殖动物造成不利影响。因此，亟须开发一种在RAS系统外的能够使MBBR载体在海水条件下快速挂膜的方法。

影响MBBR载体挂膜的因素较多，主要分为载体因素和启动因素。载体因素方面，载体的材质、形状和孔隙对挂膜有直接影响。研究表明，具有表面脊的多孔生物膜载体（内部球形孔径＞1 mm）是开发高效率MBBR载体的较好选择［7］。由于塑料等材质表面的亲水性较差，会降低MBBR载体的挂膜效率，因此，近年来关于MBBR载体改性的研究成为热点，已有很多文章报道了亲水改性的方法［8-15］，并获得了较好的效果。启动因素主要是指启动过程中各种因素对载体挂膜的影响，其中启动过程是指获得特定滤片后进行的流化培养操作。在对海水硝化系统挂膜启动速度的系统研究中，Li等［6］制定了入口氨氮浓度逐渐减少、入口盐度逐步增加、添加颗粒有机物以及接种硝化细菌等不同策略，尝试加快挂膜启动的速度，结果显示，入口盐度逐步增加组在第63天完成硝化作用，比其他策略组快16～18 d。对影响挂膜的因素的研究还表明，气水比［16］、营养物质［17-18］、C/N［19-21］、添加菌剂［22-24］、添加成熟的生物膜［25-26］以及增加盐度［27-30］等均会影响挂膜启动速度。但是，在挂膜应用过程中观察到，很多养殖场在挂膜启动前期，载体均被充入的空气顶至滤池的顶部，无法充分接触到水，因而影响了挂膜进度。在添加营养物质方面，现有的实验室在挂膜过程中主要以氯化铵和碳酸氢钠作为氮源和碱度来源［19-21，31-32］，或使用饲料粉末［17，33-34］、壳聚糖［18］、铁离子［18］等增加营养，一些研究未综合考虑与挂膜启动相关的营养物质，另外在实际生产中可能更希望使用容易获得的低成本原料来进行挂膜。在接种菌剂的选择方面，一般污水处理挂膜的方法是直接投加活性淤泥，但活性污泥通常含有大量病原体，会带来不可预见的风险，因此该方法不推荐应用在水产养殖系统中［35］。其他的挂膜试验则是直接采用硝化细菌进行挂膜，一般是投加发酵工程生产的单一的硝化细菌种群，未考虑细菌生态中不同生态位群体的互补性，因而挂膜效果也不理想［6］。另外，水质监测和对膜片颜色及孔隙生成物的监测也非常重要，需要及时从数据中获得信息，指导调节相关指标，如果对挂膜过程的监测不足，容易错过改进挂膜效率的时间窗口。

本研究将通过搅拌滤片，采用低成本的海水配方、专用营养液和多样化的菌种等方法和措施进行试验，对各项影响MBBR载体挂膜的因素进行优化改进，以期在人工海水条件下实现载体的快速挂膜。

1 材料和方法

1.1 材料

待挂膜载体材料为试产的“滤片S”。详见图1。“滤片S”是采用直径30 mm的圆柱形塑料棒材，用刀头切割成1 mm厚的“S”型弯曲片状结构。使用显微CT法测得的“滤片S”的比表面积约为1 600 m2/m3。在每口挂膜池中，滤片的堆积体积为400 L，填充率约为20%。

1.2 试验分组及试验步骤

为优化载体的浸没状态，进行搅拌试验。其中搅拌组（S1组）在放入滤片和注入海水后，开启机械搅拌装置，而不开启曝气装置；不搅拌组（S0组）则是不开启机械搅拌装置，开启曝气装置。搅拌试验连续进行7 d，观察并记录滤片的运动情况。

为对挂膜过程中投加的营养物质进行优化，设置发酵营养组（FN组）和化学营养组（CN组）开展试验。FN组的试验方法为：在掛膜装置内放入滤片和注入海水后，1～5 d，添加发酵营养液每天1次200 g（以饲料干质量计），持续开启机械搅拌装置；6～10 d，关闭机械搅拌装置，开启气泵充气，添加挂膜菌剂每天1次40 mL，监测水体氨氮和pH，直至氨氮质量浓度降至小于0.2 mg/L。随后再次连续5 d添加挂膜菌剂每天1次40 mL，并开启电磁隔膜计量泵，添加化学营养液，模拟日常养殖过程中投饲后的氨氮产生过程，于9：00—11：00、15：00—17：00、21：00—23：00开启添加泵，其余时刻关闭添加泵，添加频率为2冲程/min。CN组的试验方法为：添加滤片和海水后，1～5 d，开启电磁隔膜计量泵添加化学营养液，每日添加的时间段与前述一致，添加频率为6冲程/min（与饲料提供的氮量近似），开启机械搅拌装置，随后试验方法与FN组相同。每日于9：00前检测FN组和CN组的pH、氨氮、亚硝酸盐氮，每隔15 d拍照记录滤片颜色，并用体视显微镜记录内部生成物变化情况。需要注意的是，如果试验过程中出现pH显著降低或者低于7.5的情况，应及时添加补充碳酸氢钠。试验结束后，采集挂膜好的滤片进行微生物分类测序分析，获得微生物组成和多样性数据。

1.3 试验环境、装置及配套设备

所有试验装置集中布置于长6 m、宽5 m、高2.5 m的双层不透光膜结构保温棚中。保温棚位于地下一层实验室，保持黑暗环境。

挂膜装置为2口直径1.8 m、高1.0 m的管架圆池。池壁为PVC刀刮布材质，在池的上部和底部均有排水口。池底布设6个曝气盘，呈环形均匀分布，曝气盘为直径30 cm的橡胶膜片曝气盘，橡胶蒙皮，橡胶上打有直径3 mm的小孔。充气泵采用日升LP-100型气泵，标称供气量为140 L/min，出口气压为0.042 MPa。试验池内液面高80～90 cm，容积约2 m3，在该水压下（0.008～0.009 MPa）的出气量为132～138 L/min。为确保加入滤片后水体仍能呈现充分流动状态，挂膜池配备2台气泵进行供气。气泵位于保温棚外，以确保气泵打入的是新鲜空气。挂膜期间，保证装置和设备正常运行，除搅拌试验外其余时间均开启两台充气泵，保证溶解氧充足（＞5 mg/L）。

控温装置为杭州亚仕邦泵业有限公司生产的ACW-3000型冷暖水机组，压缩机功率2 200 W，制冷量8 540 W，制热量9 000 W，循环水量3 000 L/h。通过循环泵将挂膜池内的水泵入控温装置进行水温调节。挂膜期间，控制挂膜装置内水温在（26±2）℃。

储备和调配水装置为长2.65 m、宽0.8 m、高0.9 m的玻璃水族缸。

化学营养液添加装置为SEKO电磁隔膜加药泵，型号为DMS200，流量9 L/h，最大频率160冲程/min。营养液桶为上底直径0.85 m、下底直径0.65 m、高0.85 m的柱形PP桶，容积350 L。

机械搅拌装置采用市售的液体加药搅拌机，型号为BLD09-0.75 kW，输出转速为130 r/min，桨叶直径30 cm，衬塑材质。定制不锈钢架，将搅拌机安装固定于挂膜装置的管架圆池中央，桨叶伸至距池底50 cm处。

1.4 投入品配方及配制方法

投入品包括试验用水、海水、化学营养液、发酵营养液、挂膜菌剂。其配方及配制方法如下：

试验用水为试验场地的自来水。使用常州金坛保嘉海水晶厂生产的速溶海水晶（养殖专用盐）配制海水。该海水晶基于Schmatz的人工海水配方配制，其主要原料成分见表1。参照Lake Products Company LLC的ASTM D1141—98人工海水配方［36］，添加六水合氯化锶0.095%，硼酸0.071%，即每kg海水晶添加六水合氯化锶（国药，分析纯）0.95 g和硼酸（国药，分析纯）0.71 g。配制方法为：自来水加满后，添加速溶海水晶（保嘉牌养殖专用盐，上海保嘉工贸有限公司生产）约50 kg（水的密度调整为1.024 g/mL）、23.75 g六水合氯化锶和17.75 g硼酸，利用开孔管曝气12 h，至完全溶解，并利用曝气去除游离氯气，随后静置24 h以上备用（后文称“熟化海水”）。熟化海水的成分及与天然海水［37］的成分对比见表2。除碳酸根离子和溴离子外，试验海水与天然海水成分近似。

化学营养液的配方参见Watson 1989年描述的海栖亚硝化细菌和硝化细菌的无机营养配方［38］。考虑到海水中的大量元素如Na、K、Ca、Mg已经很充足，在本配方中不做添加补充，仅考虑补充磷酸根、螯合铁离子、钼酸根以及锰、钴、铜、锌。同时，考虑到磷酸氢二盐的溶解度非常低，且易于与其他阳离子发生沉淀，因此不适宜作为溶液添加。参考国外的人工海水配方［39］，其中添加了磷酸二氢钾（盐度18，终浓度0.37 mmol/L），维生素B12（盐度18，终浓度0.1 μmol/L），以及螯合铁和金属复合溶液（含铁、锰、锌、钴），而未添加钼酸根。综合以上信息考虑，可依据培养基配方中的氨氮浓度来补充磷酸二氢钾、螯合铁和复合微量金属元素、维生素B12、复合维生素。经查询，礼蓝（上海）动物保健有限公司生产的“速补100”可以补充金属类微量元素（铁、锰、锌、钴、铜，其中铁含量4 000 mg/kg），“德维乐”可补充微量维生素，因此在本培养基中添加补充适量的磷酸二氢钾、“速补100”（礼蓝上海公司购买）、维生素B12和“德维乐”（礼蓝上海公司购买），以氨氮浓度计算的每克氨氮的营养物质添加量见表3。氯化铵和碳酸氢钠使用电磁隔膜加药泵添加，方法为：配制成氨氮质量浓度为4 500 mg/L的溶液300 L，溶液中添加约3倍质量的碳酸氢钠，充分搅拌溶解备用。该型号加药泵在试验安装位置条件下，每个冲程的添加量为1.2 mL。使用智能控制开关调节设备运行时间段，通过调节设备每分钟的冲程数来调节日添加量。考虑到配方中其他物质用量较少，挂膜池中1.8～2.0 t的水即可稀释至很低浓度，因此，其他物质按照上述剂量用一定量的水完全溶解后，均匀泼洒于挂膜池中，至下次配制营养液时再添加相同剂量的该类物质。

发酵营养液的制作过程为：将鱼苗饲料（天马牌，粗蛋白质质量分数43%）用粉碎机打碎至粉末状，用5倍体积的水充分浸泡并搅拌至稀糊状，添加奥利安（湖北）生物工程有限公司生产的混合型饲料添加剂（枯草芽孢杆菌+粪肠球菌+酿酒酵母V型）和上海亚宝水产科技有限公司生产的EM菌产品（含乳酸菌、酵母菌、硝化菌、放线菌、光合細菌和芽孢杆菌），搅拌均匀后，在黑暗处常温发酵2～3 d备用。奥利安饲料添加剂和EM菌的使用量为饲料干质量的1%～2%。

挂膜菌剂选用深圳长隆、武汉水之国和沈阳某厂家的耐盐硝化细菌，硝化细菌均为液体包装，冷藏低温运输至实验室后，置于2～8 ℃冰箱中备用。

1.5 分析指标及检测方法

水体氨氮、亚硝酸盐氮含量和pH均采用奥克丹水质分析仪进行检测，检测试剂由奥克丹公司提供，待测样品体积为4 mL。在检测较高浓度的氨氮和亚硝酸盐氮时，可以先进行稀释，一般氨氮稀释20～40倍，亚硝酸盐氮稀释20～200倍。检测前对标准曲线进行校准，氨氮校准方法参照《水质 氨氮的测定 纳氏试剂分光光度法》（HJ 535—2009），硝酸氮检测参照《海洋调查规范海水化学要素观测》（GB/T 12763.4—2007），校准用设备为普析1810PC紫外分光光度计。pH使用电极法测量，使用梅特勒托利多 FE20实验室pH计校准。氨氮（100 μg/mL）标准试剂和亚硝酸盐氮（100 μg/mL）标准试剂购自国家有色金属及电子材料分析测试中心。

滤片的观察和记录使用江南体视显微镜（JSZ5BS）。滤片颜色的拍摄在体视显微镜的白色载物台上进行。

样品的微生物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，OTU聚类分析及物种组成分析由BBI生信云V1.0依据测序数据自动分析。具体方法为：使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit对挂膜完成后的2个样品进行DNA抽提，提取挂膜载体上的微生物总基因组DNA，完成后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。以V1～V3区特异性引物V1F（5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）和V3R（5-CACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3）［40］进行PCR扩增，采用Illumina Miseq对PCR扩增产物进行测序。聚类分析时，OTU序列相似度为0.97，物种分类方法为rdp/16S［41］，将相对丰度＜0.1%的物种合并为others组。

2 结果

2.1 搅拌试验结果

搅拌组（S1组）：搅拌機运行5 min后，所有滤片即被带动进行流化运动，当搅拌停止时，约有12 cm厚的滤片露出水面；搅拌机运行1 d后，所有滤片均处于良好的流化状态，当搅拌停止时，约有10 cm厚的滤片静止浮在水面上方；搅拌机运行3 d后，所有滤片均处于良好的流化状态，当搅拌停止时，大多数滤片仍随着水流做翻滚运动，至水体完全静止时，仅有约1 cm厚的滤片浮在水面上方；搅拌机运行7 d后，所有滤片均处于良好的流化状态，当搅拌停止时，大多数滤片仍随着水流做翻滚运动，至水体完全静止时，仅有100余片滤片完全浮于水面上方，其他滤片均浸没在水体中。

不搅拌组（S0组）：当气泵开启时，位于充气出口上方直径约35 cm的圆形区域的滤片处于良好的流化状态，其余位置的滤片均处于相对静止状态；7 d后，滤片的状态与1 d时相似。

2.2 挂膜试验结果

2.2.1 氨氮和亚硝酸盐氮

挂膜试验期间氨氮和亚硝酸盐氮质量浓度的变化情况见图2。

发酵营养组（FN组）：试验开始后1～10 d，氨氮浓度上升速度较慢，第11天时氨氮浓度达到峰值（20.36 mg/L），第14天开始下降，并于第27天时氨氮质量浓度降至0.10 mg/L，此时亚硝酸盐氮质量浓度升至21.15 mg/L，第28天开始持续添加化学营养液，至第38天时，亚硝酸盐氮质量浓度上升至最高，为45.28 mg/L，随后以每日9.60～11.76 mg/L的降幅连续下降3 d，至第46天时，亚硝酸盐氮质量浓度下降为0.10 mg/L，随后，水体氨氮和亚硝酸盐氮均处于极低水平（＜0.1 mg/L）。

化学营养组（CN组）：试验开始后1～5 d，氨氮浓度上升速度较快，且与化学营养液的日添加量呈明显的线性关系，第6天时氨氮质量浓度达到峰值（25.12 mg/L），随后于第9天时开始缓慢下降，第14天开始快速下降，第22天时氨氮质量浓度已降至0.10 mg/L以下，从第23天开始持续添加化学营养液，至第40天时，水体亚硝酸盐氮质量浓度达到最高，为53.20 mg/L，随后以每日2.54～7.30 mg/L的降幅连续下降7 d，至第56天时降至0.10 mg/L。

2.2.2 滤片颜色

挂膜过程中各试验组滤片颜色的变化情况见图3。FN组的滤片（后文称FN滤片）颜色随着挂膜时间的增加逐渐由黄色转为褐色，CN组的滤片（后文称CN滤片）也有相似的变化趋势，但是同一时间点FN滤片的颜色均较CN滤片的颜色深。在试验第60天时，CN滤片上带有颜色的物质有部分脱落现象，表明CN滤片的挂膜牢固程度较差。结合氨氮和亚硝酸盐氮的检测结果来判断挂膜情况，当FN滤片挂膜完成时（约45 d）的颜色与CN滤片挂膜完成时（约60 d）的颜色相似。

2.2.3 滤片孔隙生成物

挂膜试验过程中滤片孔隙生成物的情况见图4。由于FN组采用了发酵营养物质，水体颜色呈浅棕色，因此在后期的检查中FN滤片孔隙周围的颜色均较CN滤片深。第15天时，FN滤片内仍有一些残留的微小饲料颗粒，CN滤片则较为干净；第30天时，FN滤片视野内已可见大量菌丝状生成物，CN滤片视野内则仅见零星位置有菌落状生成物；第45天时，FN滤片视野内的孔隙表面几乎完全被一层棕黄色生物膜覆盖，CN滤片视野内也可见零星分布的黄色生成物；第60天，FN滤片视野内的孔隙表面棕黄色生成物明显增厚，CN滤片视野内零星分布的黄色生成物也有增加，但仍有部分区域裸露出滤片原有的白色。

2.2.4 微生物群落组成分析

本次试验分析共计鉴定出105个分类操作单元（operational taxonomic unit， OTU），其中FN组和CN组共同享有67个OTU，FN组总计鉴定出92个OTU，独有25个OUT；CN组总计鉴定出80个OTU，独有13个OTU。

门水平下的群落组成结果见图5。结果显示，变形菌门、拟杆菌门和浮霉菌门在两个样品中的占比均超过3%，且排序相同。另外，样品中也有检出放线菌门和疣状微生物门细菌。

纲水平下的群落组成结果见图6。各组中，α变形菌纲占比超过45%，占绝对优势。FN组中腐败螺旋杆菌纲及β变形菌纲占优势，占比分别为22.0%和11.4%；CN组中γ变形菌纲及黄杆菌纲占优势，占比分别为25.3%和9.7%。

属水平下的群落组成结果见图7。FN组中，红杆菌科（Rhodobacteraceae）某属占比为24.7%，占绝对优势；其次是腐败螺旋菌目（Saprospirales）某属，占比21.9%；然后是亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas，占比10.7%）和硝化杆菌属（Nitrobacter，占比8.1%）。CN组中，海杆菌属（Marinobacter）占绝对优势，占比为16.7%；其次是假氨基酸杆菌属（Pseudaminobacter，占比10.4%），硝化杆菌属占比6.9%，亚硝化单胞菌属占比5.7%。

2.2.5 硝化细菌组成分析

样品中硝化细菌的组成及序列数见表4。在FN组中鉴定出4个OTU的亚硝化细菌属细菌，而CN组中仅鉴定出2个OTU，检出序列数也明显低于FN组。

3 讨论

3.1 浸没状态改进

MBBR中的载体依靠曝气和水流的提升作用处于流化状态，但在实际工程中，容易出现局部载体堆积的现象［42］。搅拌试验的结果也显示，在仅曝气的条件下，1周后，MBBR中的滤片仍大量堆积在顶部，而未能浸没在水中。在增加搅拌的条件下，滤片能够很好地浸没在水中。搅拌和曝气都是移动床生物膜反应器中常见的让载体流化的装置，曝气大多用于好氧装置，搅拌大多用于厌氧装置［43］。RAS中涉及的硝化反应的MBBR大多是好氧装置［3］。本试验将MBBR中通用的搅拌装置应用于硝化挂膜过程中来解决滤片堆积的问题，加速流化进程，取得了良好的效果。能够浸没在水中自由悬浮，标志着滤片已完成了流化。据分析推测，由于流化后滤片表面的微气泡被去除，改善了亲水性，将更有利于硝化细菌的附着。因此，后续试验选择经搅拌浸水后的滤片，也有助于加快挂膜进程。

3.2 海水配方与营养物配方

大多数与海水养殖MBBR系统有关的试验均采用天然海水［6，44］。本试验结果显示，使用经改进的商业海水晶配制的海水，其主要成分与天然海水接近，挂膜结果表明，人工海水未对挂膜产生不利影响。商业海水晶配方的主要区别在于微量元素的不同［45］。本试验将挂膜过程中的投入品分为了人工海水和营养物质，其中人工海水基于Schmatz配方，只包含大量元素，由于这种商业海水晶的价格较低廉，这也为将来实际应用中大批量人工海水挂膜提供了一种较为经济的途径。

添加的营养物质一般为氮源和生长消耗物质。除了使用碳酸氢钠和氯化铵外［31］，一些研究采用海水鱼养殖过程中的粪便和饲料按比例与海水混合后的物质作为营养物质，获得了较好的挂膜效果［6，34，44］。本试验采用两种商业菌剂与饲料发酵形成的发酵营养物，获得了比单纯使用氯化铵试剂更快的挂膜速度和更稳定牢固的挂膜效果。

本试验中的化学营养物中额外添加了磷酸盐。由于硝化细菌体组成中的含磷量仅为含氮量的1/11左右，因此硝化细菌种群的扩大需要大量的磷［43］。在实际生产中，水产动物的粪便和饲料中均含有比较丰富的磷，所以一般以这些物质为营养的挂膜试验中，磷不会缺乏，但是若纯粹使用化学试剂来配制营养液，则需要考虑添加磷酸盐以补充磷。

滤片颜色变化的结果显示，使用发酵营养物的FN滤片上带有颜色的物质较不易脱落。从孔隙生成物的情况看，FN滤片中存在与CN滤片不同的丝状菌落。研究显示，在生物膜组成菌种中，放线菌（放线菌门）可以抵御剥落［40］，且放线菌可以存在于高盐环境中［46］。但本试验中，最终滤片上的微生物占比较多的属主要来自变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。结果提示，在营养物质中添加放线菌并不会增加滤片上的放线菌，另外，抵御剥落的细菌可能不仅来自于放线菌门，还来自于变形菌门和拟杆菌门，这还需要进一步研究。

在RAS中添加营养物质还须考虑引进外来菌种的风险［6］。通常在海水养殖系统中，营养物发酵后将面临高盐环境，且在后期将遭遇高亚硝酸盐的环境。国标显示，食品中亚硝酸盐含量约20 mg/kg（肉罐头约50 mg/kg）可达到防腐要求，且在人的安全食用范围内［47］。本试验中，亞硝酸盐氮质量浓度最高峰值为45.28～53.20 mg/L，因此可以不用考虑外来菌种带来的风险。

3.3 挂膜指标选择与时间窗口

挂膜成功的标志是氨氮处理能力良好，且亚硝酸盐开始有正向处理能力［48］。本研究中氨氮和亚硝酸盐氮质量浓度的变化显示，两组滤片均挂膜成功。从亚硝酸盐氮降至0.10 mg/L以下的时长看，FN组需要46 d，CN组则需要56 d。Li等［6］报道的最快挂膜时长为63 d。本试验结果表明，采用搅拌+发酵营养+较全面的化学营养+多样化菌种的策略可使挂膜时长缩短约27%，采用搅拌+较全面的化学营养+多样化硝化菌种的策略可缩减时长11%，上述策略均能使滤片更快挂膜。

本试验还获得了滤片颜色变化以及孔隙生成物变化的指标，但是由于采用的方法和营养物质不同，无法与已有的文献报道进行比较。在实际应用过程中，针对相同挂膜水质和养殖对象环境，可以建立滤片颜色变化及孔隙生成物变化的图谱，使用图谱来指导挂膜应用。

3.4 基于微生物群落多样性的挂膜结果讨论

有文献表明，对海水挂膜滤片样本进行测序分析，当序列数达到3.6万～6.0万时，有效的OTU为455～1 062［49］。本试验中的序列数为2.0万～2.3万，有效OTU数量为80～92个，说明在实验室条件下开展的利用发酵营养物或化学营养物实施挂膜，滤片上的细菌种群数量显著低于实际养殖过程中使用的滤片。有学者研究了天然海水和人工海水中的微生物群落，结果显示，与人工海水环境样品相比，天然海水样品具有更高的耐盐和嗜盐细菌多样性［50］。因此，在实际养殖环境下使用天然海水实施滤片挂膜启动可能会获得更丰富的细菌多样性。本试验中，FN组滤片检出的OTU数量较CN组高15%，说明使用发酵营养物有助于提升挂膜过程中细菌群落的多样性。

已有的研究表明，利用海水挂膜的滤片上的微生物以变形菌门（30.27%～56.94%）、拟杆菌门（11.5%～17.21%）和浮霉菌门（5.81%～14.95%）为主，疣微菌门相对丰度较小［25，49-51］，本试验获得了相同的结论。结果表明，虽然使用了不同的营养液来源，但最终获得的挂膜滤片上的微生物门类及其占比类似。在纲水平上，赵越［44］的研究表明，α变形菌纲和γ变形菌纲细菌占优势，与本研究获得的结果相似。属水平上，不同养殖环境中的优势菌不同，主要优势菌有unclassified_Rhodobacteraceae［49］，unclassified_Flavobacteriaceae［49］，亚硝化球菌属［49，52-53］和硝化杆菌属［26］，其中与氨氮处理有关的细菌为亚硝化球菌属和硝化杆菌属。有研究表明，海水环境中的亚硝酸盐氧化均以硝化杆菌属为主，淡水环境则以硝化螺旋菌属（Nitrospirea）为主［26］。以上结果与本研究获得的结果一致。结果表明，从滤片上微生物群落的组成和多样性角度看，无论在门、纲、属水平，最终获得的滤片均与挂膜成熟的滤片类似。

本研究对不同营养组的亚硝化球菌属和硝化杆菌属的OTU数量进行分析，结果表明，与化学营养组相比，发酵营养组获得的挂膜滤片上起硝化作用的细菌多样性更丰富，且占比更高，这说明在实施挂膜启动时，应多使用营养丰富的营养物质。

4 结论和展望

本研究结果表明，通过搅拌滤片，采用低成本的海水配方、专用营养液，以及选择多样化的菌种等方法和措施，可以实现人工海水条件下MBBR滤片的快速挂膜。建议在提供合适营养液的条件下逐步增加氨氮压力，以获得更高的氨氮处理能力，在使用本试验装置提高氨氮处理能力时，建议增加对硝酸盐的监测，以使硝化细菌在良好的水环境下增殖繁育。

参考文献

［1］COSTELLO C，CAO L，GELCICH S，et al.The future of food from the sea［J］.Nature，2020，588（7836）：95-100.

［2］NAVADA S，VADSTEIN O，TVETEN A K，et al.Influence of rate of salinity increase on nitrifying biofilms［J］.Journal of Cleaner Production，2019，238：117835.

［3］TIMMONS M B，GUERDAT T，VINCJ B J. Recirculating aquaculture［M］.4th ed.New York：Ithaca Publish Company LLC， 2018.

［4］朱燕.移动床生物膜反应器在启动过程中生物膜性质基础研究［D］.南京：南京大学，2015.

［5］ANG D，HWANG Y，SHIN H，et al.Effects of salinity on the characteristics of biomass and membrane fouling in membrane bioreactors［J］.Bioresource Technology，2013，141：50-56.

［6］LI C W，LIANG J W，LIN X C，et al.Fast start-up strategies of MBBR for mariculture wastewater treatment［J］.Journal of Environmental Management，2019，248：109267.

［7］RAJ DEENA S，KUMAR G，VICKRAM A S，et al.Efficiency of various biofilm carriers and microbial interactions with substrate in moving bed-biofilm reactor for environmental wastewater treatment［J］.Bioresource Technology，2022，359：127421.

［8］CHU L B，WANG J L，QUAN F，et al.Modification of polyurethane foam carriers and application in a moving bed biofilm reactor［J］.Process Biochemistry，2014，49（11）：1979-1982.

［9］TIAN X，SCHOPF A，AMARAL-STEWART B，et al.Carrier surface modification for enhanced attachment and growth of anammox biofilm［J］.The Science of the Total Environment，2022，811：151317.

［10］李春梅.MBBR填料表面親水性改性及对污水厂尾水深度脱氮的影响研究［D］.兰州：兰州大学，2016.

［11］郭志涛.新型悬浮填料的研制及应用研究［D］.南京：南京大学，2011.

［12］杨东方，齐崴，苏荣欣，等.填料表面亲水改性对MBBR处理船舶生活污水的影响［J］.环境工程学报，2014，8（5）：1895-1898.

［13］李倩.改性聚乙烯悬浮载体挂膜及其脱氮性能研究［D］.大连：大连理工大学，2015.

［14］MAO Y，QUAN X，ZHAO H，et al.Accelerated startup of moving bed biofilm process with novel electrophilic suspended biofilm carriers［J］.Chemical Engineering Journal，2017，315：364-372.

［15］张清宇.不同表面改性方法强化聚氨酯载体生物挂膜及除污染性能的试验研究［D］.西安：西安建筑科技大学，2021.

［16］马晓娜，李贤，张延青，等.气水比对移动床生物滤器净化海水养殖废水的影响［J］.海洋科学，2017，41（8）：46-52.

［17］LUO G Z，XU J X，LI J Y，et al.Rapid production bioflocs by inoculation and fertilized with different nitrogen and carbon sources［J］.Aquacultural Engineering，2022，98：102262.

［18］胡小兵，陈红伟，聂勇，等.挂膜方法对生物膜特性及生化尾水深度处理的影响［J］.中国环境科学，2021，41（12）：5710-5717.

［19］CHEN X，XIANG Z Z，HUANG X，et al.Effect of C/N ratio on nitrogen removal of A/O-MBBR process for treating mariculture wastewater［J］.Journal of Ocean University of China，202 0（4）：879-885.

［20］WU S，PAN Y，LU S，et al.Effect of C/N Ratio on the performace of moving bed biofilm reactor treating mariculture wastewater［J］.Periodical of Ocean University of China，2021，51（6）：99-108.

［21］吴淑妍，潘云浩，鲁帅领，等.碳氮比对移动床生物膜反应器处理海水养殖废水性能的影响［J］.中国海洋大学学报（自然科学版），2021，51（6）：99-108.

［22］李秋芬，康传磊，张艳，等.高效脱氮菌强化挂膜生物滤器对海水养殖尾水净化效果研究［J］.中国水产科学，202 8（5）：614-623.

［23］陈宁，王亚军，贾怀宏.生物过滤系统填料动态快速挂膜速度实验研究［J］.甘肃科技纵横，2020，49（8）：41-43.

［24］XIANG Z Z，CHEN X，BAI J，et al.Bioaugmentation performance for moving bed biofilm reactor （MBBR） treating mariculture wastewater by an isolated novel halophilic heterotrophic nitrification aerobic denitrification （HNAD） strain （Zobellella B307）［J］.Journal of Environmental Management，2023，325（Part B）：116566.

［25］TADDA M A，LI C W，GOUDA M，et al.Enhancement of nitrite/ammonia removal from saline recirculating aquaculture wastewater system using moving bed bioreactor［J］.Journal of Environmental Chemical Engineering，2021，9（5）：105947.

［26］沈加正.海水循環水养殖系统中生物膜生长调控与水体循环优化研究［D］.杭州：浙江大学，2016.

［27］NAVADA S，SEBASTIANPILLAI M，KOLAREVIC J，et al.A salty start：brackish water start-up as a microbial management strategy for nitrifying bioreactors with variable salinity［J］.The Science of the Total Environment，2020，739：139934.

［28］NAVADA S，VADSTEIN O，GAUMET F，et al.Biofilms remember：Osmotic stress priming as a microbial management strategy for improving salinity acclimation in nitrifying biofilms［J］.Water Research，2020，176：115732.

［29］NAVADA S，GAUMET F，TVETEN A K，et al.Seeding as a start-up strategy for improving the acclimation of freshwater nitrifying bioreactors to salinity stress［J］.Aquaculture，2021，540：736663.

［30］迟明磊.流化床生物膜反应器处理高盐废水效能的研究［D］.哈尔滨：哈尔滨工业大学，2011.

［31］GAO Y S，WANG X P，LI J L，et al.Effect of aquaculture salinity on nitrification and microbial community in moving bed bioreactors with immobilized microbial granules［J］.Bioresource Technology，2020，297：122427.

［32］ZHENG B，WU Y，LI Y，et al.Effect of different C/N ratio on nitrogen removal of mariculture wastewater［J］.Research of Environmental Sciences，2020，33（8）：1848-1856.

［33］王博.移动床生物滤器净化海水养殖废水的影响因素研究［D］.青岛：青岛理工大学，2013.

［34］罗荣强.海水生物滤器硝化反应动力学模型研究［D］.青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2012.

［35］KUHN D D，DRAHOS D D，MARSH L，et al.Evaluation of nitrifying bacteria product to improve nitrification efficacy in recirculating aquaculture systems［J］.Aquacultural Engineering，2010，43（2）：78-82.

［36］ASTM D1141—98 technical bulletin.pdf ［EB/OL］. ［2023-06-08］. https：//drive.google.com/file/d/1QmkJYhUODVJLhCBcDb24XovCmirgV4Fc/view？usp=embed_facebook.

［37］王宪.海水养殖水化学［M］.厦门：厦门大学出版社，2006：239.

［38］柯清水.硝化细菌与水产养殖问答集［M］.台北：养鱼世界杂志社，2002：280.

［39］Artificial seawater medium recipe［EB/OL］.［2023-06-08］. http：//web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/artificial-seawater-medium.pdf.

［40］ZHU Y，ZHANG Y，REN H Q，et al.Physicochemical characteristics and microbial community evolution of biofilms during the start-up period in a moving bed biofilm reactor［J］.Bioresource Technology，2015，180：345-351.

［41］LIU D Z，LI C W，GUO H B，et al.Start-up evaluations and biocarriers transfer from a trickling filter to a moving bed bioreactor for synthetic mariculture wastewater treatment［J］.Chemosphere，2019，218：696-704.

［42］李碧.MBBR工艺的研究现状与应用［J］.中国环保产业，2009（1）：20-23.

［43］美国水环境联合会.生物膜反应器设计与运行手册［M］.曹相生，译.北京：中国建筑工业出版社，2013.

［44］赵越.海水生物滤器工艺设计及其微生物菌群研究［D］.青岛：中国科学院大学（中国科学院海洋研究所），2018.

［45］吕本松，苗玉成，陈庆亚.高级人工海水晶的应用与市场前景［J］.盐业与化工，2008，37（6）：50-52.

［46］李艳华.嗜盐与耐盐微生物的分离与系统分类［D］.保定：河北大学，2003.

［47］国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中污染物限量：GB 2762—2017［S］.北京：中国标准出版社，2017.

［48］耿英慧，張明，徐亚同，等.移动床生物膜反应器预处理微污染原水挂膜过程研究［J］.北方环境，2003，28（1）：51-54.

［49］陈小红，郑惠东，仇登高，等.基于高通量测序的不同填料生物滤池细菌群落结构分析［J］.海洋环境科学，2023，42（4）：550-557.

［50］HE S L，NIU Q G，LI Y Y，et al.Factors associated with the diversification of the microbial communities within different natural and artificial saline environments［J］.Ecological Engineering，2015，83：476-484.

［51］DI BIASE A，FLORES-OROZCO D，PATIDAR R，et al.Performance and recovery of nitrifying biofilm after exposure to prolonged starvation［J］.Chemosphere，2022，290：133323.

［52］ZAN F，XIAO C，CHEN G，et al.Moving-bed biofilm reactor for saline wastewater treatment：Different types of carriers， versatile nitrifying reactions， and functional microbial groups［J］.Journal of Water Process Engineering，2022：50.

［53］GONZALEZ-SILVA B M，JONASSEN K R，BAKKE I，et al.Nitrification at different salinities：Biofilm community composition and physiological plasticity［J］.Water Research，2016，95：48-58.

Experimental study on rapid start-up of moving bed biofilm reactor with artificial seawater

YANG Jiping， GUO Liming， WANG Zhi， WANG Peng

（Shanghai Ocean Aquafarm Fishery Co.，Ltd.，Shanghai 200126，China）

Abstract： In the seawater recirculating aquaculture system， the biofilm formation time of moving-bed biofilm reactor（MBBR） is usually long.By using experimental strategies such as stirring filter，low-cost seawater formula，specialized nutrient solution and diversified bacterial strain selection，the rapid biofilm formation of MBBR filter under artificial seawater conditions was achieved，and an evaluation system based on ammonia nitrogen，nitrite nitrogen level，filter color，and pore products of filter was established.The fermentation nutrition group started up in 46 days，while the chemical nutrition group started up in 56 days.During the start-up process，the highest concentration of ammonia and nitrite was 20.36-25.12 mg/L and 45.28-53.20 mg/L，respectively.

Key words： recirculating aquaculture system; moving-bed biofilm reactor; biofilm formation; artificial seawater