miRNA在阻塞性睡眠呼吸暂停相关血管内皮功能障碍中的研究进展

武兴东 岳红梅,2 朱浩斌 刘苗苗 李雅亭 许金回

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)是一种常见的、严重且被低估的睡眠呼吸障碍性疾病,是指由多种原因导致睡眠状态下反复发作的上气道部分或完全塌陷,机体反复出现低通气和(或)呼吸中断,导致慢性间歇性低氧血症、高碳酸血症、胸内压大幅波动以及睡眠结构紊乱,这些事件引发了一系列相互作用的过程,进而使机体一系列病理变化。间歇性低氧(intermittent hypoxia,IH) 和睡眠碎片化(sleep fragmentation,SF)是 OSA 的主要病理生理特征。临床上,OSA患者主要表现为睡眠时打鼾、他人目击的呼吸暂停和日间嗜睡、疲乏、记忆力下降等。OSA的严重程度常以每小时呼吸暂停低通气的次数,即睡眠呼吸暂停低通气指数(apnea hypopnea index,AHI)来量化。目前认为OSA是高血压、冠心病、心律失常、心力衰竭、卒中等心脑血管病的独立危险因素,与难治性高血压、胰岛素抵抗密切相关[1, 2]。流行病学资料显示,女性发病率为6%～19%,男性发病率为13%～33%[3],全球有超过10亿的患者[2]。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是真核生物中广泛存在的一种高度保守的内源性非编码单链小分子RNA,长度约为19～25 个核苷酸,其通过与靶mRNA特异性结合,在转录后调控基因表达[4, 5]。经典的miRNA作用靶点位于mRNA的3′端非翻译区,它们可以通过破坏靶mRNA的稳定性、抑制靶mRNA的翻译来对靶mRNA发挥调控作用,从而导致基因表达的降低[6]。作为基因表达的关键调节因子,miRNA参与了细胞增殖、分化、发育和凋亡等多种细胞活动[5]。近年来的多项研究表明,miRNA参与了心血管疾病、代谢性疾病、糖尿病、癌症等多种疾病的发生发展[5, 7],这突出了miRNA作为多种疾病诊断和预后的生物标志物的潜力。

一、血管内皮的正常生理功能

血管内皮细胞是介于血流和血管壁组织之间的单层扁平上皮细胞,它形成血管的内壁。内皮细胞是沿着整个循环系统,由心脏直至最小的微血管。血管内皮细胞具有多种功能,主要通过衍生的血管活性物质发挥其生理作用,这对于维持血管系统的健康具有重要意义。以下对血管内皮细胞的生理功能作一概述。

1. 屏障功能

血管内皮细胞构成了血管的第一道屏障,发挥维持血管内膜光滑、防止血小板和白细胞黏附及有害物质侵入血管壁、进行物质交换和主动运转等功能,此外内皮细胞还构成胶原基底膜和平滑肌细胞保护层。

2. 调节血管张力

内皮细胞能够通过自分泌、内分泌及旁分泌三种途径合成和分泌多种血管活性物质,如一氧化氮(NO)、前列环素(PGI2)、内皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)等,以保证血管正常的收缩和舒张,起到维持血管张力、调节血压等作用[8]。

3. 维持凝血和纤溶系统的平衡

在生理条件下,内皮细胞主要表现为抗凝和纤溶活性,这是由于内皮细胞能够合成和释放许多抗凝、促进纤溶的活性物质,如血栓调节蛋白(TM)、蛋白S(PS)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、PGI2、组织型纤溶酶原激活物(tPA)等,而在外伤、感染、休克等病理状态下,可释放某些促凝和抑制纤溶的活性物质,如组织因子(TF)、白细胞介素1(IL-1)、血管性假血友病因子(VWF)、血浆纤溶酶原激活抑制剂(PAI)等,内皮细胞主要表现为促凝和抑制纤溶。

4. 参与炎症反应

内皮细胞在炎症反应中发挥着重要的作用。急性炎症时,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1可诱导内皮细胞产生大量PGI2、血小板活化因子(PAF)、内皮源性超极化因子(EDHF)等,它们可以舒张血管,使内皮细胞的间隙增大,并降低血管壁对缩血管物质的反应性,有利于炎症介质的渗出和白细胞向炎症部位迁移[8]。此外,当机体发生炎症时,P-选择素、E-选择素、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等黏附分子在内皮细胞表面的表达上调,参与内皮细胞与白细胞的黏附、活化[8]。

5. 参与血管生成

血管形成,即从已有的血管上抽芽生成新的毛细血管。血管形成有许多关键步骤,包括:内皮细胞活化,基膜破裂、粘连、迁移,内皮细胞扩增,中空的管腔形成,以及最后新的血管从已有血管上萌发[9]。这一多步骤过程依赖于血管形成促进因子和抑制因子的协调产生,血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成最关键的驱动因素。

二、内皮功能障碍及其评估方法

内皮细胞衬于血管表面,作为守护血管健康的第一道屏障,直接感受血管内环境,如炎性信号、激素水平、血流剪切力等信息的改变,并能通过分泌多种血管活性物质进行调节,以维持血管内环境的稳态。在OSA发病过程中,内皮细胞暴露于循环中增强的多种因素,包括循环缺氧、代谢紊乱和炎症等,导致血管内皮功能障碍。内皮功能障碍不仅表现为血管收缩和舒张功能的紊乱, 还包含内皮炎症增强、白细胞黏附增多、氧化应激、内皮增殖与迁移能力增强以及内皮屏障功能受损等[10]。之前的研究表明,OSA引起的IH可能通过NO合成减少及生物利用度下降、氧化应激、炎症、内皮细胞凋亡、内皮微粒、内皮细胞与循环炎性细胞的相互作用以及损伤修复等途径导致内皮功能障碍[11]。

非侵入性评估血管内皮功能方法有检测血流介导的血管舒张功能(flow mediated dilation,FMD)、测定外周动脉张力(peripheral arterial tonometry,PAT)、测定颈动脉内-中膜厚度(carotid intima-media thickness,cIMT)、测定心外膜脂肪厚度(epicardial fat thickness,EFT)、检测脉搏波传导速度(pulse wave velocity,PWV)、测定踝肱指数(ankle-brachial index,ABI)及趾肱指数(toe-brachial index,TBI)等[12]。

三、miRNA在OSA中的差异性表达

研究表明,miR-664a-3p[13],miR-130a[14],miR-223[15],miR-185[16, 17],miR-145[17],miR-630[18],miR-16,miR-718,miR-1249,miR-193,miR-218,miR-30b[19],miR-30a[20],miR-26b,miR-207[21],miR-107,miR-485-5p,miR-574-5p,miR-199-3p[22],miR-34a-5p[23],miR-146a-5p[24],miR-126-3p,let-7d-5p,miR-7641,miR-1233-5p,miR-320b,miR-145-5p,miR-107,miR-26a-5p[25],miR-155[26]等miRNA在OSA患者及动物模型中差异性表达,并参与各种病理生理过程。miRNA在OSA中的的差异性表达与OSA的诊断、病情及预后评估相关,并且可能参与了OSA的发生发展,这表明了miRNA用于OSA诊断、病情评估以及未来用于治疗的价值。

四、miRNA在OSA相关血管内皮功能障碍中的研究

由于miRNA在炎症、氧化应激及脂质代谢紊乱中发挥着至关重要的作用,所以,在OSA患者群体中,miRNA能够通过作用于相应的潜在靶基因调节不同的信号途径,引起动脉粥样硬化,进而提高卒中、冠心病等心脑血管疾病的风险[27]。许多研究表明,miRNA通过调节与内皮细胞功能密切相关的基因表达参与内皮和血管功能的调节[28-30]。因此,miRNA途径是血管内皮功能障碍的一种重要的分子机制。

自噬是细胞的自我更新过程,依赖溶酶体降解受损的细胞器和蛋白质,可维持细胞稳态,在调节内皮细胞通透性、调控内皮一氧化氮合酶、调控内皮止血、调控内皮细胞能量代谢等方面起重要作用。OSA可通过缺氧、氧化应激、内质网应激、内皮功能障碍、miRNA等诱导自噬[31]。自噬的失败或抑制会导致内皮细胞凋亡增加和内皮完整性破坏,促进内皮功能障碍。Liu等[19]通过对慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)模型小鼠内皮细胞凋亡和自噬相关miRNA的研究中发现,miRNA通过调节凋亡和自噬相关基因的表达在CIH中发挥重要作用。在此次实验中,为了探讨miRNA在CIH致小鼠主动脉内皮细胞损伤中的作用,采用miRNA微阵列分析法测定了正常对照组和CIH组的miRNA表达谱,结果表明CIH组6个miRNAs与正常对照组比较有明显变化(P<0.05),8个miRNA与正常对照组比较无明显变化(P>0.05)。对这6个变化显著的miRNA采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证,结果表明CIH组mmu-miR-30b、mmu-miR-193、mmu-miR-1249和mmu-miR-218表达上调,mmu-718和mmu-miR-16表达下调,与基因芯片杂交结果一致。本研究还发现mmu-miR-193、mmu-miR-1249、mmu-miR-218、mmu-miR-718和mmu-miR-16参与凋亡相关靶基因的调控,mmu-miR-30b、mmu-miR-193和mmu-miR-1249参与自噬相关靶基因的调控,其中mmu-miR-193和mmu-miR-1249是细胞凋亡和自噬的关键调节因子,mmu-miR-193下调可减轻CIH引起的血管内皮细胞损伤,同时自噬和凋亡相关蛋白的表达也降低。此外,有研究表明,miRNA在自噬和控制自噬相关蛋白6(Beclin-1)表达中发挥着关键作用[32-34],编码Beclin-1的BECN1已被鉴定为miR-30a的直接靶点[35, 36]。miR-376b是另一种调节BECN1的miRNA。Korkmaz等[37]表明miR-376b通过直接调节细胞中2种关键的自噬相关蛋白BECN1和ATG4C来调节自噬。Bi等[20]在一项研究中发现CIH小鼠模型中miRNA-30a显著上调,miRNA-30a能够靶向作用于自噬相关蛋白6(Beclin-1)mRNA的3′-非编码区,进而调控其在内皮细胞中的 Beclin-1蛋白翻译,从而调节内皮细胞自噬。与正常组比较,在CIH 时,miRNA-30a高表达使内皮细胞中 Beclin-1 蛋白减少,自噬细胞减少,此时超声心动图显示小鼠心功能障碍;同CIH 组比较,通过对CIH 组小鼠尾静脉注射慢病毒抑制miRNA-30a表达后,内皮细胞Beclin-1蛋白增多,自噬细胞增多,此时超声心动态图显示小鼠心功能障碍明显改善。这项研究表明CIH 时,内皮细胞自噬可能通过miRNA-30a介导 Beclin-1 的翻译控制而减弱,进而引起内皮细胞功能障碍和损伤,通过反义miRNA-30a(as-miR-30a)的表达抑制miRNA-30a显著增加了Beclin-1水平,从而增强了体外和体内内皮细胞自噬,改善了内皮细胞在CIH条件下的存活率。因此,miRNA-30a在OSA相关内皮功能障碍中也扮演着重要的角色。

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)由磷脂双分子层及各种囊内容物组成,是一种由细胞主动向外释放的膜性小囊泡。它们携带多种内容物,包括蛋白质、脂质、代谢产物和核酸,特别是mRNAs和miRNAs,这些物质被输送到靶细胞,在细胞间通讯中起着重要作用[38]。根据生物学特性或释放途径不同可将EVs分为微囊泡(MV)、外泌体、内体和凋亡小体。其中外泌体是存在于生物体液中的直径为30～100nm的EVs[39]。作为参与细胞间转移和通讯的囊泡,外泌体于1983年由Pan及其同事首次发现[40, 41]。Khalyfa等[18]在一项关于OSA患儿循环血浆外泌体miRNA与内皮功能障碍关系的研究发现,从患有OSA的肥胖或非肥胖儿童中分离的血浆外泌体主要来源于内皮细胞。外泌体miRNA-630在内皮功能障碍患儿中表达降低,并且在治疗后随着内皮功能恢复而恢复正常。此外,对无内皮功能障碍受试者用miRNA-630抑制剂转染外泌体后会诱导出内皮功能障碍的功能表型,这表明外泌体miRNA-630的减少会引起内皮功能障碍。miRNA-630可以作为潜在OSAS和(或)肥胖儿童血管功能和心血管疾病风险的一个新的关键介质。Bhattacharjee等[42]证明了来自患有重度OSA的成年受试者的血浆外泌体能够诱导内皮功能障碍,并且这种特性在PAP治疗6周后减弱。此外,他们在PAP治疗前后对8名受试者的外泌体货物成分进行miRNA阵列分析,从而揭示了四种miRNA(miRNA-16-5p、miRNA-4459、miRNA-451a和miRNA-6510-5p)的差异表达。国内一项研究表明,来自于CIH暴露小鼠血清/红细胞的EVs可将功能性miR-144递送至内皮细胞,通过降低核因子红细胞2相关因子2(NRF2)表达促进超氧阴离子的产生,进而导致内皮功能障碍[43]。此外,该研究还表明,在低氧条件下,miR-144可能受到低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的直接调控或HIF-1α/GATA1信号通路的间接调控。这项研究表明了负载anti-miR-144的细胞外囊泡可能代表了一种治疗OSA或CIH相关内皮功能障碍的有前景的治疗方法。外泌体具有独特的特性─天然稳定性、低免疫原性、生物相容性和良好的生物膜渗透能力,这允许它们作为药物递送的天然纳米载体发挥作用[44]。随着现代精准医学的发展及对于OSA相关分子机制的探索,利用外泌体作为药物递送的载体将会成为OSA及OSA相关心血管疾病的一种有希望的治疗方法。

线粒体功能障碍也是导致血管内皮功能障碍的一个重要因素。在病理条件下,线粒体功能障碍会导致活性氧(ROS)产生增多和三磷酸腺苷(ATP)缺乏,然后进一步破坏线粒体功能和细胞稳态,形成一种恶性循环,加剧血管内皮损伤[45]。线粒体功能障碍的特征是线粒体膜电位降低和ROS产生增加,ROS介导的氧化应激会促进血管内皮细胞衰老。线粒体功能障碍还会增加血管内皮的通透性,进而损害血管内皮的屏障功能。因此,线粒体功能的正常对于血管内皮发挥正常的生理功能具有重要意义。一项涉及临床、体外和动物实验的研究揭示了OSA可以通过诱导miR-210水平的升高引起线粒体功能障碍,进而引起内皮功能障碍[46]。间歇性低氧诱导固醇调节元件结合蛋白2 (SREBP2) 与miR-210启动子区域结合,反式激活miR-210,进而抑制铁硫簇组装酶(ISCU),损害氧化磷酸化,导致线粒体功能障碍。因此,SREBP2-miR-210-ISCU轴可能是miR-210诱导血管内皮功能障碍的潜在机制。此外,在这项实验中SREBP2抑制剂白桦脂醇减轻了OSA小鼠模型中间歇性低氧所引起的收缩压的增高。因此通过抑制miR-210或SREBP2为预防或治疗OSA相关内皮功能障碍提供了一种新的思路。此外,之前的研究表明,在肺动脉高压中,来源于骨髓的miR-210可以直接从血浆转运到肺内皮细胞,引发血流动力学和血管的变化,从而支持循环miR-210参与疾病发病的观点[47]。作为一种低氧诱导的miRNA,miR-210在内皮功能中的作用为研究OSA的发病机制提供了新的分子视角[48]。

五、总结与展望

OSA是一种以CIH和SF为特征的睡眠呼吸障碍性疾病,它是一种重要的全球性公共卫生问题,现已日益受到重视。血管内皮细胞是守护血管健康的门户,血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化、卒中等心脑血管疾病的早期预警信号。OSA可以通过CIH诱导的炎症、氧化应激等引起血管内皮功能障碍,加速心脑血管疾病的进展。近年来,通过大规模微阵列分析和遗传学方法,人们发现了miRNA在CIH引起的血管内皮功能障碍中扮演着重要的角色。作为引起血管内皮功能障碍的一种重要的分子机制,miRNA可能通过调节凋亡和自噬相关基因的表达抑制自噬,促进内皮细胞凋亡,破坏内皮的完整性,以及介导线粒体功能障碍、介导炎症及氧化应激等途径引起内皮功能障碍。对于OSA中miRNA的探索将有助于寻找治疗OSA以及OSA相关心脑血管疾病的潜在方法。随着工程化外泌体的发展以及对于OSA相关分子机制的探索,利用外泌体作为药物递送的载体将有希望成为一种新的治疗方法。因此,未来需要开展更多的研究去探索miRNA在OSA中所发挥的作用。