微小RNA-133a-5p在丙泊酚防治大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的作用及作用机制

郝伟，范惟，王佳妮，王超

内蒙古自治区人民医院麻醉科，呼和浩特 010017

缺血再灌注（I/R）损伤是肝脏创伤治疗、肝切除和肝移植过程中不可避免的病理生理学过程，通常会引起创伤性失血性休克、肝脏损伤或移植功能障碍[1］。肝脏I/R损伤的确切机制尚未明确，微循环功能障碍、氧化应激反应及钙超载等机制可能在肝脏I/R损伤中发挥重要作用。有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）是参与氧化应激反应的重要信号通路[7］。有丝分裂原激活的蛋白激酶6（MAPK6）是细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）途径中的重要组成蛋白，也是细胞应激信号的关键媒介。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类小的非编码RNA，可能是肝脏I/R损伤重要的调节因子。微小RNA-133a（miR-133a）在心肌细胞形成、心脏发育和心肌I/R损伤中发挥关键作用。研究[10］发现，肝癌组织、细胞中miR-133a表达下调，且miR-133a 能促进肝癌细胞的凋亡。我们前期研究[2］发现，MAPK6 是miR-133a-5p 的一个作用靶点。既往研究[3］发现，多种麻醉药物可减轻肝脏的I/R 损伤。丙泊酚（2，6-二异丙基苯酚）是一种快速、短效的全身麻醉药物，具有抗氧化作用，对心脏、肾脏和肝脏I/R 损伤均有防治作用。但目前丙泊酚在肝脏I/R 损伤中的具体作用机制尚不明确。为此，我们观察了miR-133a-5p 在丙泊酚防治大鼠肝脏I/R 损伤中的作用，并进一步探讨其可能作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞、试剂及仪器 纯系雄性清洁级健康SD 大鼠42 只，体质量为200～250 g，由内蒙古自治区人民医院实验动物中心提供。实验前，动物均按照SPF级标准饲养，昼夜12 h交替，进食饮水不受限制。手术前12 h进行禁食但饮水自由。所有对实验动物的操作符合由中国实验动物管理委员会发布的《实验动物护理和使用手册》。人源正常肝脏细胞系QSG-7701 购自于美国模式菌种收集中心（ATCC）。丙泊酚购自Sigma-Aldrich（中国上海）。抗MAPK6 和b-actin抗体购自Cell Signalling Technology（Boston， MA）。MiR-133a-5p mimic、miR-133a-5p 抑制剂和相应的对照物均购自Ribobio（中国广州）。

1.2 丙泊酚对I/R大鼠肝功能及肝组织miR-133a-5p、MAPK6 mRNA表达影响观察

1.2.1 大鼠分组、肝脏I/R 模型构建 取18 只大鼠，分为丙泊酚组、模型组及对照组，每组6 只。腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，将其固定于消毒手术台上气管插管并使用正压呼吸机，暴露大鼠腹部，在腹部正中间位置伤口最小化剖腹并将肝周围韧带离断使肝门区充分暴露。将大鼠肝脏左叶、中叶的肝门三管系统（动脉、静脉和胆管）分离，用微创动脉血管夹将分离的脉管夹闭以阻断血液供给（缺血），l mL 生理盐水腹腔注射补充流失体液和血液，取4-0的黑色丝线缝合腹部切口。缺血60 min（缺血）后移除微创动脉血管夹恢复供血（再灌注），黑色丝线缝合伤口，并覆上伤口贴。丙泊酚组在缺血再灌注操作的同时注射丙泊酚0.6 mg/（kg·min）。对照组不做任何处理，除不用微创动脉血管夹将肝脏中叶及左叶血管夹闭以外，其余手术步骤与其余两组大鼠一致。

1.2.2 三组大鼠血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测 再灌注结束时，采集大鼠下腔静脉血4 mL，4 000 r/min离心12 min，采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST。实验重复测算3次，取平均值。

1.2.3 三组大鼠肝组织miR-133a-5p 及MAPK6 mRNA 检测 采血后用断头法将大鼠处死将大鼠肝脏缺血组织分离。采用qRT-PCR 法检测三组大鼠肝组织miR-133a-5p、MAPK6 mRNA。用TRIzol试剂（Invitrogen， CA， USA）分离组织和细胞的总RNA。为了确定miR-133a-5p， 使用 miRNA 专用引物和Taqman MicroRNA 反转录试剂进行反转录。根据制造商的说明，使用 Taqman miRNA 检测试剂（Applied Biosystems） 进行定量实时PCR（qPCR）分析。被用作miRNA水平数据标准化的内部参考。所有操作均严格按照标准SYBR Green RT-PCR试剂盒说明书进行，miRNA及MAPK6 mRNA分别以RNU6B、GAPDH为内参，具体步骤及条件参考文献[7］。以2-ΔΔCt代表miR-133a-5p、MAPK6 mRNA 的相对表达量。实验重复测算3次，取平均值。

1.3 miR-133a-5p 抑制剂联合丙泊酚对I/R 大鼠肝功能及肝组织miR-133a-5p、MAPK6mRNA 表达的影响观察

1.3.1 大鼠分组、模型构建及丙泊酚和miR-133a-5p抑制剂给予方法 另取24只大鼠分为甲、乙、丙、丁组，每组6 只。四组均对肝脏进行缺血再灌注操作，甲组在缺血再灌注操作的同时肝脏注射丙泊酚0.6 mg/（kg·min）及miR-133a-5p 抑制剂，乙组、丙组在缺血再灌注操作的同时肝脏注射丙泊酚0.6 mg/（kg·min）、丙泊酚+等量生理盐水，丁组不做任何处理。

1.3.2 各组大鼠血清AST 及ALT、肝组织MAPK6 mRNA 检测 在灌注结束时，采集大鼠下腔静脉血4 mL，采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST。采血后用断头法将大鼠处死，分离肝脏组织，采用qRT-PCR 法检测三组大鼠肝组织MAPK6 mRNA。实验重复测算3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 17.0 统计软件。正态性分析采用 Shapiro-Wilk 检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用独立t检验； 不符合正态分布的连续性变量用中位数和四分位间距表示，两组间比较采用 Mann-WhitneyU检验；计数资料以频率和构成比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠血清AST、ALT 活性比较 丙泊酚组、模型组及对照组大鼠血清AST 分别为（312 ±73）、（1 210 ± 173）、（45 ± 5）μ/L， ALT分别为（616 ±185）、（1 711 ± 201）、（207 ± 28）μ/L。与对照组比较，模型组大鼠血清AST、ALT 活性升高（P均＜0.01）；与模型组比较，丙泊酚组大鼠血清AST、ALT活性降低（P均＜0.05）。

2.2 三组大鼠肝脏组织miR-133a-5p、MAPK6 mRNA 相对表达量比较 丙泊酚组、模型组及对照组大鼠肝脏组织miR-133a-5p 相对表达量分别为（0.94 ± 0.08）、（0.43 ± 0.12）、（1 ± 0），丙泊酚组、模型组及对照组大鼠肝脏组织MAPK6 mRNA 相对表达量分别为（1.56 ± 0.23）、（2.76 ± 0.43）、（1 ± 0）。与对照组比较，模型组大鼠肝脏组织miR-133a-5p相对表达量降低、MAPK6mRNA 相对表达量升高（P均＜0.01）；与模型组比较，丙泊酚组大鼠肝脏组织miR-133a-5p相对表达量升高、MAPK6mRNA 相对表达量降低（P均＜0.01）。

2.3 四组大鼠血清ALT、AST 水平及MAPK6 表达比较 甲乙丙丁四组大鼠血清ALT 分别为（1 701 ±103）、（503 ± 127）、（525 ± 131）、（1 231 ± 125） μ/L；AST 分 别 为（1 150 ± 104）、（206 ± 76.0）、（215 ±83.0）、（1 051 ± 210）μ/L；肝组织MAPK6 mRNA 相对表达量分别为1 ± 0、0.41 ± 0.12、0.34 ± 0.07、0.93 ± 0.06。与甲组比较，乙组大鼠血清ALT 和AST 水平及肝组织MAPK6mRNA 相对表达量低（P均＜0.01）；与乙和丙组比较，丁组大鼠血清ALT 与AST 水平、肝组织MAPK6 mRNA 相对表达量均升高（P均＜0.01）。

3 讨论

丙泊酚是一种快速和短效的麻醉剂，其结构与a-生育酚相似，显示出对肝脏 I/R 损伤的防治作用。由于这一特性，研究集中在丙泊酚对I/R 损伤的影响。丙泊酚可以防止脑I/R 损伤的大鼠在缺氧和缺葡萄糖后自噬细胞死亡[11］。在肝脏 I/R损伤的家兔模型中，丙泊酚缓解了肝脏中的窦道充血、细胞质空泡化和肝细胞坏死[12］。据报道，丙泊酚可以通过增加肝脏血流来维持肝脏的氧平衡，以补偿增加的氧消耗。丙泊酚还可以通过维持线粒体功能来保护肝脏免受I/R 损伤，这与MPTP 和GSK-3b 的调节有关[13］。在本研究中，我们也发现丙泊酚对肝脏I/R损伤有防治作用。本研究中，丙泊酚明显降低了肝脏I/R 损伤大鼠体内的血清AST 和ALT 的水平。此外，丙泊酚可防止I/R 诱导的miR-133a-5p 的减少，并降低肝I/R 损伤大鼠和暴露于H/R 的肝细胞中MAPK6 的表达。我们发现抑制miR-133a-5p 逆转了丙泊酚对肝脏I/R 损伤大鼠的防治作用，证明miR-133a-5p 和MAPK6 可能在某种程度上参与了丙泊酚对肝脏I/R损伤的防治作用。

本研究设计通过测定miR-133a-5p及MAPK6水平，阐明丙泊酚的保护性分子机制。miR-133a-5p是miR-1/miR-133 miRNA 簇的成员。miR-133a的过量表达可能通过靶向蛋白激酶2 来抑制I/R 损伤介导的心肌细胞凋亡，表明了miR-133a 可能是缺血性心脏病的潜在治疗方法[14］。在本研究中，miR-133a-5p在肝脏I/R 损伤大鼠的肝脏组织中被下调，这被丙泊酚所逆转。

MAPK6 被认为是一个细胞应激信号的关键媒介，可被冷应激、干旱应激、创伤应激或氧化应激激活。ZHANG 等[15］报道，ERK3 在氧化应激的早期阶段被H2O2上调。本研究中发现miR-133a-5p 可以调节大鼠肝脏组织中MAPK6 的表达。丙泊酚保护肝脏免受I/R 损伤，与miR-133a-5p 和 MAPK6 的调控有关，可能为今后开发肝脏I/R 损伤的诊断和治疗策略提供有用的线索。

综上所述，丙泊酚能减轻肝脏I/R 大鼠的肝损伤、促进肝脏组织miR-133a-5p 表达，抑制肝组织MAPK6 mRNA 表达。抑制miR-133a-5p 表达可逆转丙泊酚对肝脏I/R 大鼠肝损伤的防治作用，丙泊酚可能通过调控肝脏组织miR-133a-5p 表达，进一步抑制肝组织MAPK6mRNA 表达，减轻大鼠的肝脏I/R损伤。