利用拉曼技术检测抗原抗体的研究与进展

陈海云，凌伟航，林晓，吴惠文

（南宁壮博生物科技有限公司，广西 南宁 530007）

1 拉曼技术检测抗原抗体的原理

抗原(antigen,Ag)是指能与T 细胞、B 细胞抗原受体或抗体特异性结合，具有启动免疫应答潜能的物质，抗体(Ig)是由抗原刺激机体免疫系统后产生，并能与相应抗原发生特异性结合的物质。抗原检测的是病原体的组成蛋白，如果检测结果为阳性，说明生物体内含有病原体的组成成分，可直接确认为感染病例。抗原检测样本类型一般为感染部位的样本，例如，口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、血清、血浆等。抗体检测的是生物体内免疫系统为应对病毒感染而产生的抗体，如果检测结果为阳性，说明生物体内存在针对病毒的抗体，生物体正处于感染期或已经康复，可作为辅助手段帮助确诊感染，抗体检测样本类型一般为血液，包括血清、血浆和全血。传统的抗原抗体检测方法主要有免疫胶体金技术、ELISA技术、表面凝集技术等，这些技术操作简单，不需要额外仪器，反应迅速，一般在5min 内出结果，但大多只能定性，仅可判断阴阳性，无法数据化，且质量参差不齐，病原检测敏感性差。近年来，很多科技工作者研究利用拉曼技术检测抗原抗体，有望应用于临床，实现更精准的定性定量的检测。拉曼光谱是散射光谱，是一种对分子结构进行识别的检测技术,根据特征峰的位置和强度反映出物质的结构与含量信息。传统拉曼光谱信号极弱，必须能排除瑞利散射光，才能高效地收集拉曼光谱，易受荧光干扰,检测灵敏度低，限制了其应用范围，而且抗原抗体本身拉曼信号及其微弱，直接采用拉曼光谱仪照射的方法，并不能检测出抗原抗体。为克服这些缺点，科研人员相继研发了辅助技术来增强拉曼信号强度。目前，在检测抗原抗体中最常用的是表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman spectroscopy, SERS）芯片技术，大多应用的原理是利用金属纳米颗粒包裹抗原抗体再与芯片结合，形成一个三明治结构，以此提高拉曼图谱的信噪比，增强不同拉曼峰图的差异性,合成高灵敏的SERS 标记物是提高SERS 灵敏性的关键因素。金/银纳米颗粒是最常用作SERS 标记物的材料。SERS 信号的增强主要依赖电磁场增强和化学增强，使其荧光背景低、不受水干扰，可实现痕量无损检测，近年来，随着研究者不断的研究与技术更新，利用SERS 芯片技术搭配拉曼激光的检测手段已成为生物医学检测的最有力技术之一。

2 基于拉曼技术检测抗原抗体的相关研究

病毒抗原抗体的快速检测对疾病的诊断与预防有着重要意义。近年来，不少科研学者不断尝试利用拉曼激光结合信号增强SERS 芯片对各种病毒的检测进行研究与优化，同时在医学癌症和相关免疫疾病的检测中也有大量的研究成果，其中，C 反应蛋白（CRP）作为诱导炎症反应的早期生物指标，2018 年，Rong Z 等合成了具有内置热点的拉曼报告分子，将其嵌入金核-银壳纳米颗粒，然后再与CRP 检测抗体缀合，通过金银颗粒包裹抗体后产生增强的拉曼信号，经过多次实验验证可定量检测最低限为0.01ng/mL-1，显示出了较强的定量检测能力。癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA),是大肠癌组织产生的一种糖蛋白，作为抗原可引起患者的免疫应答反应，癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物，但其特异性不强，灵敏度不高，对肿瘤早期诊断作用不明显。2014 年，Chunyuan Song，Linghua Min 等人，利用拉曼光谱结合SERS 芯片标记金纳米颗粒增强抗原信号，超灵敏地检测癌胚胎抗原。在这项研究中，利用新型金纳米作为SERS 标记和SERS活性磁性纳米颗粒支持底物，开发出了一种癌症标记物CEA 检测方法。在0.01fg/mL 至1ng/mL 浓度范围内，检测出的拉曼SERS 信号强度光谱图呈良好的线性关系，可达到最低检出限为0.01fg/mL。

寨卡(Zika)单股正链RNA 病毒，和我们平时熟知的登革热(dengue fever)、西尼罗病毒病以及丙肝病毒属于同一类病毒。这些病毒的基因组均是通过蚊虫叮咬感染和传播，罕见血液传播和性传播。导致的病症通常是较轻微的。但是，一旦婴幼儿感染会引发严重的疾病，导致死亡常见症状包括轻微发热或皮疹，一般在被受感染蚊子叮咬几天后才出现，利用传统的检测技术难以检测到如此低浓度的病毒含量。2017 年，S NCHEZ-PURR M，CARR-CAMPS M，PUIG H 利用拉曼激光结合表面增强SERS 芯片的高灵敏度对寨卡病毒和登革热病毒进行多重分析，基于这个技术区分出了寨卡和登革热非结构蛋白1（NS1）的生物标志物。经过SERS 编码的金纳米颗粒能与这两种疾病的特异性抗体结合，利用抗原抗体包被金颗粒相结合的原理检测出2 种病毒非结构蛋白，并利用试纸免疫定性，拉曼仪器定量，其对寨卡NS1 和登革热NS1 的检测限分别能较传统胶体金免疫层析技术，分别提高了感染寨卡病毒和登革热病毒的阳性检出率15倍和7 倍，而且可以在感染后生物标志物水平较低时都能尽早检测出这两种病。

在流行病毒方面，2019 年，KUKUSHKIN V I，IVANOV N M 等学者采用表面增强拉曼散射（SERS）技术，建立了流感病毒检测的适体传感器。为了获得高灵敏度，组装了一级适体、流感病毒和二级适体的“三明治”。将一级适体连接到SERS 底物的金属颗粒上，捕获流感病毒并与用拉曼活性分子标记的二级适体结合。信号受初级和次级适体浓度的影响。检出限低至10-4，每个探针4个血凝单位，用于检测H3N2 病毒（A/England/42/72）。基于适体的传感器可识别各种流感病毒株，包括H1、H3和H5 血凝素亚型。SERS 将拉曼信号放大106 ～109 倍，产生极好的灵敏度。Ralbovsky NM, Halámková L 等利用拉曼高光谱技术结合机器学习开发了一种基于唾液分析的阿尔兹海默症诊断新方法。使用拉曼高光谱技术分析从正常人、阿尔兹海默症和轻度认知障碍（MCI）个体收集的唾液样本。将遗传算法和人工神经网络机器学习技术应用于拉曼光谱数据集以构建诊断算法。其研究结果示，区分这三类的准确率达到99%。

除了可以检测以上提到的病毒与疾病，因其利用拉曼技术可以直接对生物样本进行检测，无须对组织、唾液、血清等样本进行复杂的处理，大大提高其检测效率与成本，其价值促使科研学者对这项技术表现出了极高的研发狂潮，近年来，研究出了利用拉曼技术快速检测鼻咽癌、胰腺癌、胃癌和食管癌等方法。由此可见，拉曼技术作为一种无创、高效、准确的诊断方法具有显著的潜力。

3 国内外制备拉曼相关产品情况

近年来，为了获得最优的拉曼增强信号，研究者发现控制粒子的团聚变得非常重要。常用于制备拉曼芯片的刚性基底材料有玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷(POMS)、晶体硅等，其中石英芯片的透光性好、拉曼背景低，但价格昂贵，玻璃和晶体硅机械强度大、通道表面易修饰，聚二甲基硅氧烷(POMS)，其成本价格较低，但针对病毒检测效果不太理想，易产生记忆效应。近年来，利用柔性材料替代刚性材料作为芯片基底越来越普遍。杨峰、文枰等人采用滴铸法来制备柔性的SERS 芯片，发现了铝箔在波长为532nm 激发光具有很高的反射率，选择了铝箔作为衬底，使增强效果高至1.32×108。ZengFY 等基于常用滤纸和银纳米颗粒（AgNP）制备了纸基SERS 芯片，成功用于检测低浓度的典型SERS 分析物模分子，包括罗丹明6G 和结晶紫。Reokrungruang P 等研制出了一种简单且成本效益高的等离子体纸作为拉曼表面增强SERS 柔性基底，将普通滤纸浸入金纳米棒溶液中制备等离子体激元纸，结合磁分离成功用于癌症的检测与筛查。Oliveira M J 等利用两种不同类型的纸制备SERS 衬底：高孔隙率纸和低孔隙率纸。将含有银纳米星（AgNSs）的溶液滴铸在纸上图案化的亲水孔上。大多数纳米颗粒保留在办公纸基材的照明表面。经过验证，沉积AgNs 的办公纸基材，拉曼信号显著增强且在储存5 周后保持稳定，但纸张本身的拉曼信号会造成干扰。综上，在工艺简单和低成本的要求下,制备具有稳定、均一、普适性强，能显著减少咖啡环效应的SERS 基底仍然处于一个研发成果全面开花但并未实现商业化的状态，依旧面临巨大的挑战，成功之路道阻且长。

国外的拉曼光谱检测系统研发起步较早，技术方面相对较成熟，市场已普遍存在满足科研测量要求的台式拉曼光谱仪器和便携式的手持拉曼光谱仪，但价格还相对昂贵。拉曼光谱仪市场容量近几年不断增长，主要市场情况为应用在毒品检测和药品检测、发酵工艺实时监测等方面。应用于商业化检测抗原抗体尚未有任何例子，即主要原因即为对抗原抗体与金银纳米粒子的包被与结合，包被好的粒子还要考虑拉曼增强芯片的结合与干扰，虽检测这方面快速便捷，但这道前处理的过于复杂的工序和要搭建的庞大拉曼光谱数据库就让很多学者望而却步。

4 结语

综上，拉曼检测技术作为前景广阔、便利快捷的检测技术，可帮助更快捷便利地检测出抗原抗体，并能实时定量地检测出病毒在生物体内的变化过程，然而，拉曼光谱技术想在检验行业真正地、广泛地应用于临床与商业化，仍然存在诸多挑战。其中，研制出能直接不借助辅助芯片就能提高信号的拉曼光谱仪是走向广阔市场，走向人民的关键，而且现在的仪器分析图谱算法过于复杂，需要配备拉曼检测仪器标准化且可靠易操作的数据分析方法，将复杂的拉曼光谱数据算法转化为简单易懂的可视结果，并且建立其庞大的不同物质的全面的拉曼光谱特征峰数据库是一项复杂且长远的工作。当然，这个数据库一旦能建立起来，也将成为一类相当宝贵的资源。而对于最常用的辅助增强芯片SERS 方法来说，目前是仍旧无法获得具有良好稳定性和适用性的SERS基底且前处理过程并不便利。相信随着技术的进步以及研究者的不断努力，拉曼光谱技术可以在不久的将来广泛应用于生物样本检测，为临床实验室和基层现场诊断提供一种颠覆性的前沿技术。