一株蜡样芽孢杆菌产抑菌物质发酵条件优化及抑菌效果研究

戴悦 彭金菊 张腾月 谢星朋 罗帅帅 谭绮梅 文娇 马驿

摘要 从广东湛江红树林自然保护区的红树植物根际土壤中分离筛选出一株广谱抑菌效果的菌株蜡样芽孢杆菌M15，对菌株M15进行发酵培养条件优化，采用特定发酵培养基的基础上，控制单一变量，对装液量、接种量、发酵温度和发酵时间进行优化，并对其抑菌活性物质的酸碱稳定性、热稳定性和蛋白酶耐受性进行测定。结果表明：菌株M15的发酵条件为装液量30 mL、接种量2%、发酵温度30 ℃、发酵时间120 h时，发酵液的抑菌效果最佳，对大肠杆菌、链球菌和沙门氏菌抑菌圈直径均为17 mm，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为15 mm；发酵培养基pH小于5.0或者大于6.0时，抑菌活性丧失；菌株M15的发酵液抑菌活性在30 ～60 ℃较稳定，但≥80 ℃时，发酵液抑菌物质失去活性；抑菌物质对胰蛋白酶不敏感，对木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感。

关键词 蜡样芽孢杆菌；抑菌物质；发酵条件优化；抑菌效果

中图分类号 TQ 920  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）06-0006-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.002

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Fermentation Conditions and Inhibition Effect of a Strain of Bacillus cereus Producing Inhibitory Substances

DAI Yue，PENG Jin-ju，ZHANG Teng-yue et al

（Department of Veterinary Medicine，College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524000）

Abstract A broad-spectrum antibacterial strain，Bacillus cereus M15，was isolated and screened from the rhizosphere soil of mangrove plants in Zhanjiang Mangrove Nature Reserve，Guangdong，the fermentation culture conditions were optimized for strain M15，using a specific fermentation medium based on the control of a single variable，the loading volume，inoculum，fermentation temperature and fermentation time.And its bacterial inhibitory active substances were measured for acid-base stability，heat stability and protease tolerance.The results showed that the fermentation conditions were 30 mL，2% inoculum，30 °C fermentation temperature and 120 h fermentation time，the fermentation solution had the best bacterial inhibition effect，and the circle diameter of inhibition for Escherichia coli，Streptococcus and Salmonella were 17 mm，and the circle diameter of inhibition for Staphylococcus aureus was 15 mm.When the pH of fermentation medium was less than 5.0 or more than 6.0，the antibacterial activity was lost;the antibacterial activity of fermentation broth of strain M15 was stable at 30-60 ℃，and the antibacterial substance of it loses activity when ≥80 ℃;the antibacterial activity was not sensitive to trypsin，but sensitive to papain，streptomycin E and proteinase K.

Key words Bacillus cereus;Bacteriostatic substances;Optimization of fermentation conditions;Inhibition effect

抗生素作為抗菌药物广泛应用于各种领域，但抗生素的滥用导致很多致病菌对其耐药性增加，甚至出现超级细菌［1-2］。因此，急需研究和开发有抗菌活性的药物来治疗细菌性疾病。细菌素是一类由细菌核糖体合成的抗微生物蛋白质或多肽，其具有无耐药性、不残留、能够抑制或杀死某些致病菌等特点，可用于临床预防和治疗细菌感染性疾病［3-5］。

作为一种动植物微生态中的优势菌种，芽孢杆菌具有丰富的种类和广泛的来源，它们可以在土壤、水体、空气以及动物肠道等环境中被发现，具有多样性和普遍性［6-7］。研究表明，芽孢杆菌所产生的细菌素比乳酸菌产生的细菌素抗菌谱更广，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用，能更加适应环境和应用生产中酸碱度和高温等影响因素，这些优良特性提示芽孢杆菌产生的细菌素和类细菌素具有广泛的应用前景［8］。其中，蜡样芽孢杆菌可以分泌多种细菌素，分泌的细菌素有cerein 7、cerein 7B、cerein 8A、cerein MRX1等［9-11］。该研究从红树植物根际土壤中分离具有广谱抑菌效果的菌株M15，经鉴定为蜡样芽孢杆菌，对其进行发酵培养条件优化，并对其抑菌活性物质的酸碱度稳定性、热稳定性和蛋白酶耐受性进行测定，确定该菌产抑菌活性物质的最佳培养条件。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

从广东湛江红树林自然保护区的红树植物根际土壤中分离具有广谱抑菌效果的菌株，筛选一株对病原菌拮抗作用最好的菌株，通过全基因测序分析，菌株被鉴定为蜡样芽孢杆菌，命名为蜡样芽孢杆菌M15。

1.2 指示菌株

大肠杆菌（批号为D0028B）、金黄色葡萄球菌（批号为F0009B）、沙门氏菌（批号为F0014B）、链球菌（批号为G0041DX），均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 培养基

发酵培养基：每100 mL培养基中含葡萄糖 4.00 g、牛肉膏0.50%、酵母提取物0.50 g、蛋白胨1.50 g、NaH2PO4·2H2O 0.02 g、Na2HPO4·2H2O 0.05 g、Mg2SO4·7H2O 0.05 g、CaCl2 0.02 g、MnSO4 0.02 g。

LB液体培养基，购自北京陆桥技术有限公司。

1.4 菌株的发酵液培养及抑菌活性测定

蜡样芽孢杆菌M15在28 ℃条件下培养过夜后，在发酵培养基中接种，置于28 ℃的恒温培养箱中培养72 h后，将发酵液置于离心机离心以获得上清液，4 ℃、8 000 r/min 离心30 min。上清液的无菌处理：离心获得的上清液采用滤膜过滤法进行无菌处理，滤膜孔径为0.22 μm。采用固体琼脂打孔法分别测定无菌發酵液对4种指示菌的抑菌效果，每组重复3次，采用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.5 菌株发酵培养条件优化

1.5.1 装液量对发酵液抑菌活性的影响。

以2%的接种量分别将培养过夜的蜡样芽孢杆菌M15接种至发酵培养基中，4个不同的培养基装液量（30、50、70 和100 mL）置于恒温振荡器中，28 ℃、180 r/min培养72 h后，重复3次测量不同装液量对发酵液抑菌物质活性的影响。

1.5.2 接种量对发酵液抑菌活性的影响。

将培养过夜的蜡样芽孢杆菌M15分别以6个不同的接种量（1%、2%、4%、6%、8%和10%）至装有30 mL发酵培养基的锥形瓶中，置于恒温振荡器中，28 ℃、180 r/min培养72 h后，重复3次测量不同接种量对发酵液抑菌物质活性的影响。

1.5.3 发酵温度对发酵液抑菌活性的影响。

以2%的接种量将培养过夜的蜡样芽孢杆菌M15接种至30 mL发酵培养基的锥形瓶中，5个不同的温度（28、30、34、37和40 ℃）置于恒温振荡器中，180 r/min培养72 h后，重复3次测量不同发酵温度对发酵液抑菌物质活性的影响。

1.5.4 发酵时间对发酵液抑菌活性的影响。

以2%的接种量将培养过夜的蜡样芽孢杆菌M15接种至30 mL发酵培养基的锥形瓶中，7个不同时间（24、48、72、96、120、144和168 h）置于恒温振荡器中，30 ℃、180 r/min培养，重复3次测量不同发酵时间对发酵液抑菌物质活性的影响。

1.6 抑菌物质酸碱稳定性的测定

采用孔径为0.22 μm滤膜，对离心获得的蜡样芽孢杆菌M15上清液进行无菌处理后，分别用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液调节6个不同的pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），室温放置1 h，测定发酵液对指示菌的抑菌效果，每组重复3次，比较抑菌物质的酸碱稳定性，将未处理组设定为对照组。

1.7 抑菌物质热稳定性的测定

采用孔径为0.22 μm 滤膜，对离心获得的蜡样芽孢杆菌M15上清液进行无菌处理后，在4个温度（40、60、80、100 ℃）的水浴锅中放置30 min，待温度降低至室温后，测定热处理后的发酵液对指示菌的抑菌效果，比较抑菌物质的热稳定性，每组重复3次，将未处理组设定为对照组。

1.8 抑菌物质对蛋白酶耐受性的测定

采用孔径为0.22 μm 滤膜，对离心获得的蜡样芽孢杆菌M15上清液进行无菌处理后，在上清液中分别加入浓度均为1 mg/mL的4个蛋白酶（木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E、胰蛋白酶、蛋白酶K），37 ℃水浴锅中放置1 h，测定发酵液对指示菌的抑菌效果，比较抑菌物质对不同蛋白酶的耐受性，每组重复3次，将未处理组设定为对照组。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

由图1可知，M15全基因组与NCBI数据库已知芽孢杆菌全基因组对比，运用PGAP1.2.1软件，构建Neighbor-joining物种间系统进化树，菌株M15和蜡样芽孢杆菌BAG5X12-1亲缘关系最近，菌株M15被鉴定为一株蜡样芽孢杆菌，命名为蜡样芽孢杆菌M15。

2.2 菌株发酵培养条件优化

2.2.1 装液量对发酵液抑菌活性的影响。

由表1可知，装液量≥70 mL时，发酵液对4种指示菌均无抑菌活性；装液量在30 mL时，发酵液对4种指示菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最佳，故选择30 mL的装液量。

2.2.2 接种量对发酵液抑菌活性的影响。

由表2可知，6个不同接种量的发酵液对4种指示菌的抑菌圈直径差异不明显，其中接种量为2%时发酵液抑菌圈直径最大，故选择2%的接种量。

2.2.3 发酵温度对发酵液抑菌活性的影响。

由表3可知，发酵温度在40 ℃时，发酵液对4种指示菌的抑菌圈直径最小；发酵温度在30 ℃时，发酵液对4种指示菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最佳，故选择30 ℃的发酵温度。

2.2.4 发酵时间对发酵液抑菌活性的影响。

由表4可知，发酵时间为24 h时，发酵液对4种指示菌的抑菌圈直径最小；在120 h时，发酵液对4种指示菌的抑菌圈直径最大，抑菌效果最佳，故选择120 h的发酵时间。

2.3 抑菌物質酸碱稳定性的测定

由表5可知，与对照组比较（对照组pH与细菌培养时发酵液的pH一致，为5.5），不同酸碱度对抑菌活性物质影响差异较大，发酵培养基pH小于5.0或者大于6.0时，抑菌物质活性丧失，pH为5.5时，发酵液抑菌活性最强。

2.4 抑菌物质热稳定性的测定

由表6可知，与对照组比较（对照组温度与细菌培养时的最佳温度一致，为30 ℃），发酵液经过不同温度处理后，在40～60 ℃抑菌效果有所下降，但是抑菌活性依旧接近90%，故发酵液抑菌物质活性在30～60 ℃较稳定，但≥80 ℃时，发酵液抑菌物质失去活性。

2.5 抑菌物质对蛋白酶耐受性的测定

由表7可知，与对照组比较（对照组不加酶），胰蛋白酶处理后的发酵液对4种指示菌的抑菌活性无变化；木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E和蛋白酶K处理后的发酵液对4种指示菌的抑菌活性下降。故抑菌物质对木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感，对胰蛋白酶不敏感。

3 结论与讨论

该试验从红树植物根际土壤中分离具有广谱抑菌效果的蜡样芽孢杆菌M15，对其发酵条件进行优化，得到最佳的发酵条件：装液量30 mL、接种量2%、发酵温度30 ℃、发酵时间120 h时，发酵液中抑菌物质效果最佳。刘瑾等［12］对芽孢杆菌P9培养基及发酵条件优化，得到发酵温度30 ℃、发酵时间72 h，抑菌物质抑菌圈比初始抑菌圈直径扩大1.7倍。解丽娟等［13］研究发现地衣芽孢杆菌产抑菌物质的培养条件在装液量为40 mL、接种量为2%时，发酵后菌液浓度最高，得到的抑菌物质也是最高。与文献相比，该试验的芽孢杆菌M15发酵条件与上述文献报道的芽孢杆菌发酵条件相近时，所产抑菌活性物质的抑菌效果最佳。

在对蜡样芽孢杆菌M15的抑菌物质的稳定性试验中发现，发酵液的pH在5.0～6.0时，抑菌物质活性较高，说明该菌在偏酸性条件下培养可以增加抑菌物质的产量。根据研究发现，凝结芽孢生长最适合的pH在5.5～6.5［14-15］。蜡样芽孢杆菌M15的发酵液温度在30～60 ℃抑菌物质活性较稳定，但温度≥80 ℃时，发酵液抑菌物质失去活性。姚佳明［16］研究发现解淀粉芽孢杆菌B815-1发酵上清的抑菌物质在30～60 ℃上清液的抑菌活性维持较高水平，但是>80 ℃抑菌活性显著下降。刘佳慧等［17］对一株蕈状芽孢杆菌进行发酵条件优化，结果表明最佳的温度为30 ℃。蜡样芽孢杆菌M15的抑菌物质对木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶E和蛋白酶K敏感，对胰蛋白酶不敏感。张毅等［18］研究发现凝结芽孢杆菌BC99代谢产物对蛋白酶K水解作用敏感。于秀菊等［19］对来自羊驼肠道中的地衣芽孢杆菌AF08发酵上清液抑菌物质是否耐受蛋白酶的试验结果发现，链霉蛋白酶E处理组中，抑菌活性完全丧失。说明不同的芽孢杆菌代谢产物都可能是蛋白类产物。

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